・指南・乙型肝炎病毒耐药专家共识:2009年更新乙型肝炎病毒耐药专家委员会 自《乙型肝炎病毒耐药专家共识》[1]于2008年2月发布以来,国内外关于乙型肝炎病毒(HBV)核苷(酸)类似物耐药研究不断进展;亚太肝病学会(AP AS L)与欧洲肝病学会(E AS L)发布了其新版的慢性乙型肝炎(CHB)指南[2,3];另外,一年来,专家委员会收到大量关于《乙型肝炎病毒耐药专家共识》的反馈建议[4]。
因此,《中华实验和临床感染病杂志(电子版)》与《中国肝脏病杂志(电子版)》编辑部再次组织专家委员会成员,对最新HBV核苷(酸)类似物耐药资料以及反馈建议进行分析整理,形成《乙型肝炎病毒耐药专家共识:2009年更新》。
目前经国家食品药品监督管理局(SF DA)批准用于抗HBV治疗的核苷(酸)类似物有拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(ADV)、恩替卡韦(ET V)和替比夫定(LdT)。
另外,替诺福韦酯(T DF)已在欧美被批准;克里夫定(L2F MAU)已在韩国被批准;特鲁瓦达(Truvada,替诺福韦酯与恩曲他滨复合剂)已被批准用于抗H I V 治疗。
核苷(酸)类似物已成为继干扰素α(IF Nα)之后的又一类用于抗HBV治疗的有效药物。
大多数接受核苷(酸)类似物治疗的患者难以通过短期治疗实现持久应答,而需要接受长期治疗,这必将增加病毒耐药的风险,随着核苷(酸)类似物种类的增加,HBV耐药变异的复杂性也大大增加。
因此,迫切需要对HBV 耐药变异的相关概念和命名方法、耐药变异的检测方法以及耐药变异发生后的临床处理等问题进行规范化,以便于学术交流,提高临床诊治水平。
一、核苷(酸)类似物耐药的病毒学基础HBV[5]属于嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae),基因组长约3.2kb,是部分双链环状DNA结构。
HBV基因组含有4个部分重叠的开放读框(ORF),即前2S/ S区、前2C/C区、P区和X区。
前2S/S区编码大蛋白(前2S1+前2S2+S)、中蛋白(前2S2+S)、主蛋白(S),前2C/C区编码HBeAg和HBc Ag,P区编码聚合酶/逆转录酶,X区编码HBx Ag。
不同患者血清中的HBV基因序列存在差异,根据HBV全基因序列差异≥8%或S区基因序列差异≥4%,HBV可分成不同基因型(A～H),各基因型又可分成若干个基因亚型。
HBV侵入人体后,与靶细胞膜上的受体结合,脱去包膜,进入细胞质中,脱去核衣壳,部分双链环状HBV DNA进入靶细胞核中,在DNA聚合酶作用下,以负链DNA为模板,延长正链,修补裂隙区,形成共价闭合环状DNA(ccc DNA)。
HBV DNA的复制首先以ccc DNA为模板,在宿主RNA聚合酶的作用下,转录成3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb等大小不同的HBV mRNA,部分3.5kb的HBV mRNA作为前基因组RNA,在HBV逆转录酶的作用下,逆转录为负链DNA,再以此为模板,在HBV聚合酶的作用下合成正链DNA,形成子代病毒的部分双链HBV DNA。
其他的HBV mRNA在细胞浆中翻译成病毒的各种蛋白成分,并与子代HBV DNA装配成完整病毒颗粒,释放至细胞外。
部分子代HBV DNA,进入靶细胞核中,补充ccc DNA池,并继续复制,周而复始。
慢性HBV感染者肝细胞核中的ccc DNA半寿期长,而现有核苷(酸)类似物对于ccc DNA均无直接作用,这也是多数患者需用核苷(酸)类似物长期治疗的原因之一。
HBV每24h可复制1012～1013拷贝[6]。
HBV虽然属于DNA病毒,但其复制过程并非DNA2DNA的直接复制过程,而是经过前基因组RNA的中间过程,即DNA2RNA2DNA的复制过程。
在前基因组RNA逆转录为负链DNA的过程中, HBV逆转录酶由于缺乏严格的校正机制,导致HBV复制过程中核苷酸错配率较高,介于其他DNA病毒和RNA病毒之间,大约为1/105。
HBV复制的这种过程和特点,决定了同一患者体内不同的HBV株基因序列之间也存在差别,因此,每一个患者体内的病毒都是由存在基因序列差异的病毒株组成的动态变化的病毒群,即HBV以准种(quasis pecies)的形式存在。
HBV病毒群的演变也符合达尔文进化论的规律。
有些位点的变异,可能是致死性的,发生这种变异的HBV不能存活。
有些位点的变异对其复制能力没有显著影响,但很多位点变异导致子代病毒复制能力降低或增强。
不同基因序列的病毒株在病毒群中所占的相对比例,一方面取决于病毒株自身的复制能力,另一方面也受到机体免疫系统或药物的选择压力的影响。
核苷(酸)类似物的作用机制[7]:其进入机体后,形成三磷酸活性成分,与机体天然的脱氧三磷酸核苷(dNTP)竞争性结合到HBV聚合酶上。
但由于三磷酸化的核苷(酸)类似物不具备天然的d NTP的结构,而使HBV的DNA链合成终止,这是核苷(酸)类似物抑制HBV复制的机制。
但如果患者体内的HBV序列发生变异,导致产生的HBV聚合酶与核苷(酸)类似物结合力降低,那么变异的HBV即不受核苷(酸)类似物的抑制或抑制能力下降,因此,在继续应用核苷类似物治疗的情况下,野生株病毒因对核苷(酸)类似物敏感而继续被抑制;变异株病毒因具备一定的复制能力,而且对核苷(酸)类似物不敏感而逐渐替代野生株,成为体内HBV的优势株,从而导致患者对于核苷(酸)类似物的耐药。
二、核苷(酸)类似物耐药变异相关概念及命名方法(一)耐药变异相关概念常用的HBV耐药变异相关术语或概念有[2,3,8210]:1.原发性无应答(p ri m ary non2res ponse或p ri m ary failure,又称原发性治疗失败):指核苷(酸)类似物治疗12周,HBV DNA载量的下降幅度小于1l ogI U/10m l。
原发性治疗失败可能与宿主、药物或病毒等因素相关:患者依从性差、药物吸收障碍、药物在体内转换为活性成份能力差;药物的抗病毒效力弱或治疗剂量太小;HBV发生耐药变异等均可造成原发性治疗失败。
2.病毒学突破(vir ol ogical breakthr ough或secondary failure,又称继发性治疗失败):指在治疗过程中,相隔1个月的连续两次检查,血清HBV DNA载量比获得应答后的最低值的上升值均大于1l og,病毒学突破在治疗依从性良好的患者10常常提示耐药的产生。
3.病毒反弹(viral rebound):指患者治疗后获得病毒学应答,虽继续治疗, HBV DNA载量升高≥20000I U/m l或高于治疗前水平。
4.生化学突破(bi oche m ical breakthr ough):指治疗达到血清ALT复常后,在继续治疗的过程中,ALT水平升高并超过正常值上限。
当ALT水平上升大于5倍正常值上限则称为肝炎突发(hepatitis flare),大于10倍正常值上限则称为恶化(deteri orati on/exacerbati on)。
5.原发性耐药变异(p ri m ary drug resistance mutati on):指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异,导致变异病毒株对治疗药物的敏感性下降。
如rt M204V/I的变异病毒株对LAM的敏感性显著下降[11,12]。
虽然原发性耐药变异株对药物的抵抗性增加,但也常导致变异病毒本身的复制能力下降。
6.继发性耐药变异(secondary/compensat ory resistance mutati on,又称补偿性耐药变异):指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降,在原发性耐药变异的基础上,病毒株也可在其他位点发生变异,这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感性的进一步下降。
如在LAM的耐药变异中, rt M204V/I为原发性耐药变异,常常伴随的rt L180M变异为补偿性耐药变异[12]。
7.基因型耐药(genotyp ic resistance):指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异。
8.表型耐药(phenotyp ic resistance):通过体外复制系统证实检测到的HBV 变异会降低其对抗病毒药物的敏感性。
当抑制病毒复制所需的EC50与野生株相比增加100倍以上称为高度耐药、10～99倍为中度耐药、2～9倍为轻度耐药。
9.交叉耐药(cr oss resistance):对一种核苷(酸)类似物耐药的HBV变异对其他一种或多种核苷(酸)类似物也具有耐药性。
如LAM治疗发生在rt M204I的耐药变异株,对LdT也具有耐药性。
10.多药物耐药(multidrug resistance):指当不同作用靶位的药物进行序贯或同时治疗,HBV可在不同药物的靶位发生耐药变异,产生对多种药物耐药的变异病毒株。
如LAM治疗后,病毒变异发生在rt M204V/I和rt A181T/V,则该病毒株对LAM和ADV均耐药。
基因变异是导致病毒耐药的基础。
在临床中首先出现基因变异,然后出现病毒学突破和病毒反弹,再出现生化学突破(见图1)。
对临床病毒耐药检测结果的解释,需要结合病毒载量的变化、检测试剂和方法及临床表现来综合分析。
(二)耐药的命名方法和书写格式HBV聚合酶可分为4个不同的功能区:末端蛋白(ter m inal p r otein)、间隔区(s pacer)、逆转录酶区(reverse transcri p tase,rt)及RNA酶H(RNase H)。
已知的耐药变异均位于逆转录酶区内。
8种基因型HBV的逆转录酶均由334个氨基酸残基组成,因此目前国际通用的HBV耐药变异从rt第1位氨基酸残基作为起始,书写格式为“rt2野生型氨基酸缩写2相对于逆转录酶区起点的氨基酸变异位点2变异后的氨基酸缩写”,如rt M204V表示逆转录酶区的第204位由蛋氨酸(M)变异为缬氨酸(V)。
当在同一位点出现2种以上的氨基酸改变即混合HBV病毒群时,应同时将两种氨基酸改变列出。
例如,LAM耐药相关的rt M204V和rt M204I 突变型的混合病毒群应报告为rt M204I/V。
图1 核苷(酸)类似物治疗过程中病毒耐药变异、病毒学突破和生化学突破发生示意图 三、核苷(酸)类似物常见耐药变异位点与变异发生率1.与拉米夫定耐药相关的变异:现有研究表明[3,8],LAM常见耐药相关变异为rt M204I/V±rt L180M变异,其中rt M204V多与rt L180M变异联合出现,rt M204I 变异可单独出现。
根据已公布的LAM治疗核苷(酸)类似物初治患者的关键性临床试验(p ivotal trials)数据计算的1～5年累积耐药发生率分别为24%、38%、49%、67%与70%[2,10]。