课程设计说明书课程名称：发酵工程设计题目：酵母菌的高密度发酵院系：生物与食品工程学院学生姓名：吴亚非学号：201006040051专业班级：10 生物技术指导教师：马瑞霞2013年5月26日课程设计任务书设计题目酵母菌的高密度发酵学生姓名吴亚非所在院系生物与食品工程学院专业、年级、班10级生物技术设计要求：1、设计题目选择要求紧扣发酵工程相关教学内容和生产实际。
2、要充分查阅相关背景资料，了解相关内容的前沿进展及存在问题。
3、设计说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。
4、实验方案要切合实际，严密合理6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。
学生应完成的工作：1、在老师的指导下确定设计题目。
2、学生查阅相关文献和资料制定实验路线，并有指导老师检查实验路线的合理性和可操作性。
3、学生在实验室完成既定方案。
4、完成课程设计说明书的初稿，经过指导老师的帮助修改，最后定稿。
参考文献阅读：[1]李寅等著，高细胞密度发酵技术[M]，化学工业出版社，2006-10-01，230-280[2]陈思如，萧熙佩酵母生物化学[M]，济南：山东科学技术出版社，1990年[ 3 ] ( 日) 山根恒夫( 周斌译) , 生化反应工程( 第二版)[M] , 西安: 西安大学出版社, 1992: 243[4]Craig. T.B. and Trotter S G Intern. Symp. SCP. A lgiers A lgoria, O ct, 1983:17-20[5]陈洪章，李佐虎，酵母菌的高密度发酵[J]，工业微生物，1998-28-1工作计划：2013.5.11分组并确认指导老师，在老师指导下查阅文献，确定题目。
2013.5.12----2013.5.13 进行理论试讲阶段，确定实验路线，然后确定实验方案。
2013.5.14----2013.5.17 进行实验操作和书写设计说明书。
2013.5.18----2013.5.22 修改说明书，和指导老师沟通。
2013.5.23—2013.5.26 上交课程设计说明书，并由指导老师填写评语和成绩。
任务下达日期：2013年5月13日任务完成日期：2013年5月26日指导教师（签名）：学生（签名）：目录摘要 (1)关键词 (1)1.设计背景 (2)1.1高密度发酵的概念 (2)1.2酿酒酵母发酵过程状态 (2)1.3酿酒酵母的发酵条件 (2)2.设计方案 (3)2.1酿酒酵母简介 (3)2.2实验流程 (4)3.方案实施 (5)3.1材料 (5)3.2种子液的培养 (6)3.3发酵罐的准备 (6)3.4发酵罐的灭菌 (6)3.5接种操作 (6)3.6发酵过程中的补料 (6)3.7取样与分析方法 (7)3.8发酵罐的倒罐 (7)4.结果和结论 (8)4.1测量数据如下： (8)4.2实验曲线图及结果分析 (8)5.收获与致谢 (11)6.参考文献 (12)7.附件 (13)酿酒酵母的高密度发酵摘要：高密度培养酿酒酵母的生长状况，用上海联环生物工程设备有限公司的型号：SGJ-10L发酵罐，采用分批补料培养技术，维持葡萄糖的浓度处于一定浓度，并用分批补加氮源，同时溶氧控制在20%-80%。
PH5.0，转速300-400rpm。
培养期间每隔4h测一次数据，主要测量还原糖含量，氨基氮含量，菌体密度。
关键词：酿酒酵母;高密度培养；菌体浓度1.设计背景1.1高密度发酵的概念高细胞密度发酵是一个相对的概念,一般指发酵液中细胞浓度在30g/L以上。
但是对于一些极端微生物或自养微生物，细胞浓度如果达到1g/L也算比较高的细胞密度[1]。
酵母菌的高密度发酵是一个相对概念,一般指发酵液中酵母浓度在30 g /L以上。
酵母高密度理论值上限是多少呢? 山根恒夫[3]以面包酵母细胞在发酵液中所占体积分率的大小加以说明,不含上清液的菌体浓度最大为280g/L ,该值为物理上限。
假定细胞为形, 以最大密度堆积,可得细胞真正所占有的体积为整个细胞沉淀层体积的74% ,因此,高密度浓度可达150~ 200g /L。
一般酵母厂每升发酵液中酵母干菌体重在30 g以下[4]。
要达到高密度发酵并非易事。
限制酵母菌高密度发酵的因素主要表现在营养供给不适宜、生产抑制性物质的积累和发酵液流变学特性的影响。
1.2酿酒酵母发酵过程状态酵母菌是一种兼性厌氧菌,当酵母在低浓度的葡萄糖中进行好氧生长时，它能把葡萄糖分解成二氧化碳和水。
当酵母在厌氧条件下生长时,葡萄糖主要生成乙醇和二氧化碳。
早在巴斯德时代,人们已知道大量通风不长生乙酸,并且采用了补料技术（1915年）。
但由于酵母菌的乙醇发酵酶系是组成酶,不受其他影响,而其呼吸酶系是阻遏酶系,受其他条件影响较大[2]。
在发酵中如果提高发酵液中的碳源含量,酵母菌就会生成乙醇或乙酸,但其生物量则有所下降;如果将碳源保持在最低水平,就会限制酵母的生长.而利用分批补料发酵的方式，既可以满足高密度发酵时酵母细胞对营养源的大量需求,又能减少生长抑制物质的产生。
1.3酿酒酵母的发酵条件影响酿酒酵母高细胞密度发酵的因素：培养基的营养物质溶解氧（DO）压力CO2温度pH值发酵液的流变学接种量生长抑制性物质酿酒酵母发酵条件的确定：接种量：3%温度：30℃PH：5.0OD溶解度：20%-80%罐压：0.05MpaCO2溶解度：1%-3%转速：300rpm-400rpm调节PH：氨水补料时间：有待观察通气量：100L/h2.设计方案2.1酿酒酵母简介酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是发酵工业最常用的菌种之一酵母属大约包括40种，每个种都能通过出芽产生球状或椭圆状的细胞。
酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5-10μm，其繁殖方式为出芽生殖。
生长条件偏酸性，最适PH3.5-5.0.2.2实验流程器材、试剂、菌种的准备→种子培养液的配制与灭菌→摇瓶接种发酵罐的安装及调试→发酵罐的清洗→发酵培养基的配制灭菌→发酵罐的接种↓发酵罐条件的控制↓取样↓清洗发酵罐←培养基灭菌处理←发酵结束←补料及调节PH↑流加培养基的配制及灭菌打扫实验室→实验结束3.方案实施3.1材料3.1.1酿酒酵母由生物与食品工程学院实验室购买的酿酒酵母 3.1.2培养基种子培养基：葡萄糖25g/L,尿素3g/L ，KH 2PO 4 10g/L,MgSO 4 2.5g/L,酵母膏15g/L,PH5.0.发酵培养基：（NH 4）2SO 4 15g/L ，KH 2PO 4 8.0g/L ，MgSO 4 3.0g/L,酵母膏15g/L ，消泡剂 0.3ml/L ，ZnSO 4 0.4g/L.流加培养基：KH 2PO 4 9.0g/L,MgSO 4 2.5g/L,K 2SO 4 3.5g/L,Na 2SO 4 0.28g/L,葡萄糖500g/L 。
调节PH 的氨水浓度：30%氨水 3.1.3试剂和器材（1）试剂：葡萄糖、酵母膏、尿素、KH 2PO 4 、（NH 4）2SO 4、MgSO 4 、ZnSO 4、K 2SO 4、Na 2SO 4、 氨水、消泡剂(2)器材：电子天平、钥匙、量筒、烧杯、玻璃棒、3个1000ml 三角瓶、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅。
3.1.4发酵仪器与设备培养基种子培养基（3摇瓶用量） 发酵培养基 （用量） 流加培养基 （用量）总计（用量） 备注葡萄糖 15g 1000g 1015g酵母膏 9g 90g 99g 尿素 1.8g 1.8g KH2PO4 6g 48g 18g 72g （NH4）2SO4 90g 90g MgSO4 1.5g 18g 5g 24.5g ZnSO4 2.4g 2.4g K2SO4 7g 7g Na2SO4 0.56g 0.56g 氨水（30%） 1000ml 1000ml 消泡剂 1.8ml 1.8ml空压机；发酵罐；蒸汽加热器；分光光度仪；等3.2种子液的培养用接种环从保存斜面中接一环至装液量为60ML的1000ML摇瓶中， 250r/min,30℃，摇瓶培养24h，制作三瓶种子液。
3.3发酵罐的准备3.3.1发酵罐的清洗发酵罐的清洗发酵罐使用前后都应认真清洗，特别是前后两次培养采用不同的菌株时，更应注意清洗和杀菌工作。
发酵罐内可进行清洗的任何部分都应认真清洗，否则都可能成为杂菌的滋生地。
易被忽略而未能充分清洗的地方有喷嘴内部与取样管内以及罐顶等处。
3.3.2发酵罐溶氧电极和PH电极的校正用标准溶液校正电极3.4发酵罐的灭菌配制发酵培养基并加入发酵罐进行灭菌①排气管为硅胶管,一端装有过滤装置，以保证蒸汽能自由出入发酵罐，同时不会出现染菌现象．②取样口上连接一段硅胶管，在硅胶管上安装节流夹，以防止培养基在灭菌时流出。
③装入发酵罐容积60％的培养基后，通入高压蒸汽加热发酵罐,在121℃下灭菌20min。
当灭菌完成后，确认排气口正常后，以0.3~5L/min的通气量通入过滤气体．接通冷却水管脚开挽拌在低转速下进行培养基的冷却．3.5接种操作接种是在发酵罐顶部接种口进行。
适当降低通风量，在接种口四周缠绕上经酒精浸泡的脱脂棉，点燃后戴上石棉手套,迅速打开接种口，将菌种加入到发酵罐中，接种量为3％，然后将接种口盖子在火焰中灭菌后盖好。
在30℃，pH5.0下进行，搅拌速度为300rpm。
通气量100L/h.的条件下进行发酵培养。
3.6发酵过程中的补料进行补料培养基的配制灭菌后，用补料瓶进行补料，期间要注意无菌操作和要注意蠕动泵运转中自于硅胶管的弯曲折叠，出现的阻塞现象以及水的渗漏等问题。
特别需要注意在一定的阶段泡沫有可能大量生成。
3.7取样与分析方法3.7.1还原糖含量的测定还原糖含量测定用的是菲林试剂法。
3.7.2氨基氮含量的测定氨基氮含量的测定用的是甲醛滴定法3.7.3菌体浓度的测量用分光光度仪在OD600下测定菌液的吸光度.对于高于1.0的菌液要进行稀释，并进行吸光度的测定。
此时菌体密度即为吸收值与稀释倍数的乘积。
自培养操作开始起，每4h取一次样。
取样时将取样管口流出的最初15mL左右培养液作为废液，取随后流出的培养液10mL。
3.7.4结果的整理以时间为横坐标，分别以OD值、氨基氮含量、还原糖含量等为纵坐标做图。
3.8发酵罐的倒罐发酵过程结束，需要灭菌后再进行罐内培养基的处理。
处理培养基后进行发酵罐的清洗，保持发酵罐的干燥和完好。
并进行实验室的清洁工作。
到此实验结束。
4.结果和结论4.1测量数据如下：酵 母 菌 的高 密 度 培 养取样次数第一次 第二次 第三次 第四次第五次第六次时间 16日22:2017日04:0117日07:4517日13:2017日14:2017日18:50OD 值培养基 T 97.70% 98.20% 98.80% 99.80% 99.90% 99.70% A 0.0070.0080.0070.0020.002 0.002 菌体T 60.10% 31.20% 44.80% 13.20% 23.20% 11.20% A0.220 0.506 0.350 0.875 0.638 0.957 氨基氮测定V ml 5.6 6.2 6.1 6.1 5.4 4.9 还原糖测定 ml1.41.21.01.00.90.6注：OD 值第五次和第六次测定是稀释四倍;氨基氮测定空白对照消耗NaOH Vo=0.2ml ，V 是消耗NaOH 的体积补料时间分别为发酵开始后6h 、5h 、4h 、4h. 4.2实验曲线图及结果分析4.2.1OD 值与菌体浓度生长曲线图一：OD 值与菌体浓度的关系4.2.2氨基氮含量曲线图二：发酵过程中氨基氮的含量变化4.2.3还原糖含量曲线图三：发酵过程中还原糖含量的变化4.2.4实验结果分析图一：微生物OD值是反映菌体生长状态的一个指标，OD是optical delnsity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度。