原理：白光下，利用与标准色阶比较溶液颜色 深浅来测量物质含量（眼睛观察）
标准色阶:不同量标准液,等量的显色剂及其它试剂，稀释
未 知 样 品
一套颜色不同的标准色阶
2. 分光光度法 (spectrophotometry)
原理：测量溶液对单色光 的吸收程度对 物质进行分析（分光光度计）:
▲根据Lambert-Beer’s law
小结： △c/c 与△T和T有关
表12-2 不同T(或A)值浓度测量的相对误差
△T=0.5%
T
A △C/C×100 T A △C/C×100
0.95 0.022 0.90 0.045
10.3 0.40 0.399 1.37
5.3
0.368 0.434 1.36
0.80 0.097
2.8
0.30 0.523 1.39
与 ▲ 溶液中吸光物的本性 有关 ▲ 溶液的温度
2. 公式适用范围 ▲ 单色光 ▲ 均匀溶液(稀溶液) 气相、均相固体 ▲ 可见光区，紫外、红外区
二、吸光系数、摩尔吸光系数 K：衡量分光光度法的灵敏度（sensitivity)
A = Kbc
吸光系数a
c 的单位 b 的单位
单位
数学式
g/L cm L/g.cm A=a·b·c
A=εbc
ε=
A b·c
=0.19/(2×8.9×10-6)
=1.1×104(L/mol.cm)
E11%cm
=
10
× 1.1×104 55.85
=2.0
×103(ml/g.cm)
三、桑德尔（E.B.Sandell)灵敏度
(亦称灵敏度指数) 1. 定义：产生0.001的吸光度时，单位截面积 (cm2)
0.70 0.155
2.0
0.20 0.699 1.50
0.60 0.222 1.63 0.10 1.000 2.17
0.50 0.301 1.44 0.05 1.301 3.34
10 8
6
4
2
0.368
T
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
图12-13 浓度的相对误差与透光度的关系
说明：吸光度测量的适宜读数范围
I0
It
dx b
图12-6光的吸收示意图
-dI = k.I.c.dx
-dI/I= k. c.dx
-∫I0It dI/I= ∫0b k. c.dx -ln It /I0 = kbc
-lg It /I0 = Kbc
令 T =It/I0 T:透光度(transmittance)
或百分透光率( T%)
第三节 光的吸收定律
E11c%m表示 浓度：1%（g/mL) 时的吸光值 b：1cm
单位：mL/g.cm
与ε关系：
E11c%m
=10×
ε
Mr
例：已知Fe2+ c ：0.5mg/L b：2 cm A：0.19(λ508nm）
求：ε，E1%1cm?
解： c(Fe2+) =
0.5×10-3
=8.9×10-6mol/L
55.85
第十二章
光 度分析
Photometry
第十二章 光度分析
第一节 概 述
定义：以显色反应为基础,利用有色物质 对光的选择性吸收性能建立起来的分析法
1. 比色分析法 ( colorimetry） （目视比色法）
2. 分光光度法 (spectrophotometry)
1. 目视比色法 ( colorimetry）
一、朗伯-比尔定律 (lambert-Beer’s law)
吸光度(absorbance):
I0
It
A= - lg T
= -lg It /I0 = Kbc
A=Kbc
dx
b
T= 10-K·b·c
图12-6光的吸收示意图
A = -lgT = -lg It /I0 =K·b·c
注意: 1. 式中K称为比例常数 ▲ 入射光波长
显示仪表和记录仪
A
2.0 1.0 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.15 0.1 0.05
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
T(%) 图12-a 吸光度与百分透光度标度
721型分光光度计采用指针式的微安表
常用分光光度计
光源
棱镜
聚光镜
准直镜
反射镜 吸收池 光电管 狭缝
例：
Cr2O72- +H2O 橙色
2HCrO-4
2H+ +2CrO42黄色
（4）物理因素（散射） 溶液不均匀,呈胶体、乳浊、悬浮状
第四节 吸光度的测量
一、分光光度计. .(spectrophotometer)基本组成
光源
0.575
单色器 吸收池 检测器 显示
第四节 吸光度的测量
一、分光光度计(spectrophotometer)基本组成
所以：
S=
1 a
，
S=
M ε
四、朗伯-比尔定律的表观偏离
1、标准曲线 (校正曲线 calibration curve)
A
21
3
c
图12-5 校正曲线及朗伯-比尔定律的偏离
1、遵守朗伯-比尔定律 2、正偏离 3、负偏离
2. 偏离原因
（1）朗伯-比尔定律仅适用于稀溶液 （2）非单色入射光
（3）化学变化: 离解、缔合、溶剂化、形成 新化合物、互变异构等
1、光源： 钨丝灯（λ350~2500nm, 可见光用 ） 氘灯 （λ190~400nm，紫外光用 ）
2、单色器: 棱镜或光栅、狭缝、准直镜、反射镜 3、吸收池：石英、 玻璃 （比色皿）
4、检测器： 光电管、光电倍增管（光电转化） 5、显示仪表和记录仪：
早期：检流计、微安表 近期：数字电压表和X-Y记录仪
若有干扰组分M’： 则λmax(MR)与λmax(M’R) 相隔较远
第五节 显色反应及反应条件的选择
显色反应:
M(待测物)+R(显色剂)
一、对显色反应要求
MR(有色化合物)
2、灵敏度高 测微量组分、应选MR的ε较大
3、MR组成恒定（MR符合一定化学式）
4、MR的化学性质稳定
5、R在测定波长处无明显吸收 λ max(MR)与λ max(R)之差大于60nm
三、参比溶液的选择
用参比（空白）溶液调节透光度为100% ▲ 消除吸收池壁及溶剂、试剂、试样本身 等对入射光的反射和吸收带来的误差
▲参比溶液的选择原则
参比溶液 待测液 显色剂 其它试剂
(1) 溶剂空白 纯溶剂 (2) 试样空白 不加显色
剂的待测液
无色 有色
无色 无色
无色
(3) 试剂空白 显色剂
无
.A = Kbc
白光→单色光→溶液→A值→求被测物含量
分 类
可见分光光度法（380~780nm） 紫外分光光度法（10~380nm）
红外分光光度法（780~3 × 105nm）
分光光度法特点:
■灵敏度较高:
直接测定最低浓度： 5×10-5% 高灵敏度显色剂或富集： 10-6%~10-7%
■准确度较高:
紫红 紫 蓝
绿蓝 蓝绿
颜色
紫 蓝 绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红
吸收光
λ/nm 400～450 450～480 480～490 490～500 500～560 560～580 580～600 600～650 650～760
二、物质对不同波长的光的吸收特性
■吸收光谱(A-λ曲线) (absorption spectrum)
A= - lg T =εbc
（c
=
-
lg T εb
）
微分 - dlg T = - 0.434 dlnT = -0.434dT/T
-0.434dT/T = εb dc
-0.434dT/T dc =
εb
则dc/c = -0.434dT - T lg T
以有限值表示
则△c/c = 0.434△T T lg T
有
有
（其它试剂）
(4) 平行操作 空白
不含被测组分试样 被测液
在相同条件下同时处理
如：正常人的血样 和 待测血样
四、控制适当的吸光度读数范围
读数误差 △T
由仪器测量不准确
光源 检测器
显示系统
测量误差 总和
··
透光度读数上表现为△T △T是透光度的绝对误差，一般±0.2%～ ±1%
△T引起浓度相对误差（△cc ）
E = hv = λ ▲单色光：具有同一波长的光 ▲复合光：由不同波长光组成的光
白光:不同颜色的波长的光的吸收特性
■物质颜色与吸收光颜色的关系
紫 蓝
红 ◆对角上的颜色
橙
称为互补色
青蓝 青
◆物质的颜色与
黄 吸收光颜色为
互补色 绿
二、物质对不同波长的光的吸收特性
相对误差（RE）：
2%~5%
差示分光光度法（RE）： 0.5%
差高■示或分过操光低作光)时度简，法测便:量样、误品差中快均被速较测大组。分克浓服度这过种大缺或点浓而度改过用小浓(吸度光比度样过 品率■稍（低对应或浓用稍 溶高液广的）泛标或准0%溶透液光代率替（空对白稀试溶剂液来）调以节提仪高器分的光1光00度%透法光精
光由光量子组成，其能量与波长λ成反比
hc E = hv = λ 可见光
紫外 紫 蓝 青 绿 黄 橙 红
400 450 480 500 560 600 650
红外
760 800nm
图12-1 各种颜色光的波长范围