蛋白质组学主要技术简介
自发辐射
原子在没有外界干预的情况下，电子 会由处于激发态的高能级E2 自动跃迁至低 能级E1，这种跃迁称为自发跃迁。 自发辐射光子频率
E2 E1 h
E2 E1
h
受激辐射 当原子中的电子处 E2 E1 于高能级时，若外来 h 光子的频率恰好满足 时，电子会在外来光子的诱发下向低能 级跃，并发出与外来光子一样特征的光 子----受激辐射。 E2 E1
蛋白质组学主要技术简介
杨学习 生物技术学院
蛋白质组（proteome）
Proteome＝PROTEins + genOME，意思是
Proteins expressed by a genome（基因组表达的所
有蛋白质）。
一个基因组、一种生物或一种细胞/ 组织所表达的
全套蛋白质
人蛋白质清单的估计
同普通SDS-PAGE类似。
无需浓缩胶？
在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非 限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。
Hale Waihona Puke 注意：进行第二向SDS-PAGE时，要求恒温， 但温度不要低于15℃，否则会引起凝胶收缩， 影响蛋白从胶条向第二向凝胶的转移。
7. 2D胶的染色
理想显色剂的7S
安全（safety）：
灵敏（sensitivity）：
简单（simplicity）： 特异性（specificity）： 快速（speed）： 稳定（stability）： 兼容性（synergy）：
有机染料和银染:会减少胶内蛋白质产量。
胶体考马斯亮蓝染色灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍
形态上（普通染色）
表型或功能上（荧光染色） （同质性）
二、二维凝胶电泳技术
二维电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2DE)，又称双向电泳
第一向:等电聚焦分离，第二向:SDS-PAGE 两种不同性质
等电点
分子量
分辨率远高于其他任何一种单一的电泳方法，是目 前分析混合蛋白质样品最有效的手段。
三、生物质谱技术
原理:将样品离子化,根据不同的质量和电荷差 异确定分子量的技术
应用:蛋白质序列分析 蛋白质修饰分析
最重要的鉴定技术（支柱）
1.概述
化合物分子受到电子流冲击后，形成的带正电荷分子离子及碎片离子， 按照其质量m和电荷z的比值m/z（质荷比）大小依次排列而被记录下 来的图谱，称为质谱。
一个细胞的蛋白质组
5000条多肽
一个人瞬时的蛋白质组 100 000条多肽
一个人整个生命周期的蛋白质组 1 000 000 条多肽
蛋白质组研究整体技术的特点
规模化 通量化 自动化
技术目标（要求）
有效分离
准确鉴定
合理分析
预分离 同质 均一
激光捕获显微切割（LCM）技术
双向电泳实验流程
1. 2. 3. 4.
样品制备（Sample preparation） 固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration） 第一向等电聚焦（IEF） 胶条的平衡（IPG strip equilibration）
5.
6. 7. 8.
胶条转移
第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE electrophresis） 凝胶的染色及检测（Detection/Staining） 图像分析（Software analysis）
银染:线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。缺点是：对某些种类 的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。
负染:
能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率，但不能用于膜上染色。 结果
表现为胶面着色而蛋白质点透明。
速度快（5~15min），蛋白质的生物活性能保持。 它主要适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。
第三步：含复合表面活性剂的蛋白溶解液
膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。
1、样品制备
样品中核酸的去除
对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形
成复合物后会出现假象迁移和条纹。
解决方法：
不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解
合成载体两性电解质（SCA）同核酸结合形成复合
物，通过超速离心来去除复合物
质谱分析法（Mass Spectrometry, MS）是在高真空系统中测定样
品的分子离子及碎片离子质量，以确定样品相对分子质量及分子结构
的方法。
同位素质谱、无机质谱、有机质谱、生物质谱
发展概况:
第一台质谱仪是英国科学家阿斯顿（F.W.Aston，1877—1945）于 1919年制成的。
下室温12h,使IPG干胶条边水化膨胀边上样。
IPG IEF 中pH梯度的选择
常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，预
试验确定。
3. 第一向 等电聚焦 (isoelectric focusing, IEF)
聚焦时间的优化
理论上讲，要获得最好的图谱质量和重复性所需最佳时间是IEF分离 达到稳定态所需的时间。
Laser Capture Micro-dissection，是直接在光 学显微观察的基础上，利用激光能量对特定 的组织或细胞类型进行切割，从而获得均一 性的样品。
– 提到激光时脑海中的第一印象？
激光应用
• 军事
– 激光测距 – 直接摧毁 – 激光制导
激光应用
– 医疗：
• 最早的激光医疗应用：1961年12月在哥伦比亚长老会医院用红 宝石激光器进行了视网膜肿瘤治疗； • 肿瘤治疗； • 眼科手术：视网膜焊接、近视治疗； • 美容； • 外科手术等。
8. 图像分析
在用双向电泳进行差别表达蛋白质组分析时， 需要利用软件对产生的2D胶进行差别分析，
以寻找差别表达蛋白。
常用的软件如安玛西亚公司的Image Master
2D Elite或Image Master 2D Planium分析软件。
Image analysis with ImageMaster Platinum
德国Carl Zeiss公司PALM激光显微切割系统
第三代技术特点：
全自动系统，速度快 适应蛋白分析的需求
荧光激发模块
无接触的样品收集方式
•样品收集器可快速更换收集管 •多样品收集，可以通过软件控制自动选择样 品收集器的收集管
适用的组织样品
LCM优点和特性
快速简单、有效减少交叉污染 样品的切割与分离由激光一步完成，并可以保 持被分离的样品的完整性。 对制样的要求灵活多样，使用范围较广
发现了多种元素同位素 研究了53个非放射性元素 发现了天然存在的287种核素中的212种 第一次证明原子质量亏损。 他为此荣获1922年诺贝尔化学奖。
Present in (a) and (c) not (b)
/blog/introduction-to-2d-gel-electrophoresis/
视频
/html/video/2009/0807/1968.ht ml /html/video/2009/0807/1967.ht ml /html/video/2009/0807/1966.ht ml
第一代激光微切割技术
laser capture microdissection (LCM)
1995年Liotta教授等进一步发展的非接触性激光显微切割技 术（non-contact laser microdissection of membranemounted native tissue）使得显微切割实现了高度精确、
h
全同光子
实验表明，受激辐射产生的光子与外 来光子具有相同的频率、相位和偏振 方向。
光放大 在受激辐射中通过一个光的作用，得 到两个特征完全相同的光子，如果这两个 光子再引起其它原子产生受激辐射，就能 得到更多的特征完全相同的光子----光放 大，激光。
粒子数正常分布和粒子数反转
E2
E1
N2 N1
Laser Microbeam Microdissection LMM Laser Pressure Catapulting LPC
基于第一代的缺点，开创性地采用紫外激光沿样品外缘切割的工 作方式，利用激光离焦面的冲击力，将分离后的样品向上弹射 收集
-
系统特性： 无接触方式捕捉样本，避免污染 无热传送，无损DNA、RNA和蛋白结构或 或细胞的存活能力 激光切割精度小于1微米 可将不同种类的细胞，自动分类切割到不 同的离心管内
1、样品制备
防止化学修饰、聚集和沉淀
添加酶抑制剂
防蛋白质水解，目前多用PMSF、
EDTA/EGTA或甲苯磺酰赖氨酸氯甲酮（TLCK）
/甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）等
低温
防聚集、沉淀
2. IPG 胶条重泡胀(rehydration)和 上样(loading)
一般采用预制的IPG干胶条（商品化），需要用重泡胀 液(rehydration solution)使其重性水化膨胀成凝胶，使 样品能够充分进入凝胶内，完成上样。 可用重泡胀液在室温浸泡12h后上样，或在低电压(30v)
差别分析(Differential analysis)
