LexA蛋白 单纯疱疹病毒的VP编码区 大肠杆菌的LexA蛋白 BD AD
选择酵母细胞作为双杂交系统的宿主菌株： 1.酵母细胞具有翻译后加工功能 2. 酵母细胞有很多的营养缺陷型标记，筛选阳性 克隆比较方便、容易。 3. 酵母细胞有性生殖形成二倍体细胞，转化容易， 转化率高
构建两种可在大肠杆菌和酵母细胞中复制的 穿梭质粒载体
3. 单杂交系统
用于研究蛋白质与DNA的相互作用 检测蛋白质能否和DNA结合 筛选能和DNA结合的蛋白质
只用双杂交系统中的DNA-AD质粒，不用DNA-BD质粒， 故称为单杂交系统 待研究的蛋白质可看作双杂交系统中GAL4的BD结构域 将待研究蛋白质基因与DNA-AD质粒重组，以融合形式表达 AD-蛋白质 重组质粒转入酵母细胞
高拷贝，插入的片段小
技术操作 （一）噬菌体载体： 1. 噬菌体载体 由噬菌体基因组改造而成 含有完成噬菌体生命周期全部遗传成分 一种抗生素遗传标记 一对限制酶切点 2.噬菌粒 噬菌体和质粒的杂合体 质粒的复制子和抗性基因 噬菌体的PⅢ基因或PⅧ基因及基因间隔区 间隔区有单链DNA合成和包装信号 感染细菌后需辅助噬菌体协助包装
3. 从大肠杆菌中提取两种重组质粒共转化 酵母细胞 在缺少Trp、Leu和His,含有X-gal的培 养基上筛选 在此培养基上生长的蓝色菌落证明X 蛋白和Y蛋白能互相作用。
酵母的接合型 a接合型 α接合型 单倍体 二倍体 单倍体
DNA-BD载体 转化 a接合型酵母 Trp筛选
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
DNA-AD载体 转化 α接合型酵母
X和Y蛋白间无作用
（三）、酵母双杂交系统的应用
1. 检测两种已知蛋白质之间在体内是否存在 相互作用. 这是酵母双杂交系统最基本用途 将两种已知蛋白质的编码基因分别克 隆到BD载体和AD载体上，共同转染酵母细 胞。若报告基因得到表达，则证明两种蛋 白质之间在细胞内存在相互作用。
2. 筛选与已知蛋白质相互作用的新的蛋白质。 这是酵母双杂交技术最广泛，最有价值 的用途 将已知蛋白质基因克隆在BD载体上， 将要筛选的 cDNA库克隆在AD载体上，据 此可从cDNA库中筛选出能与已知蛋白质 相互作用的新蛋白质。
蛋白质组学研究内容
• 蛋白质鉴定： 双向电泳结果找出差异蛋白质电 对差异点蛋白质： 分子量及等电点分析 western blot或者免疫共沉淀等技术初步鉴 定蛋白质种类 质谱技术分析蛋白质的氨基酸序列 在数据库中比对确定蛋白质的家族归属。
• 蛋白质的修饰： 真核生物蛋白质翻译后会进行修饰： 磷酸化 乙酰化 糖基化 这些修饰是调节蛋白质功能的重要方式
酵母单杂交原理示意图
4. 反向双杂交系统 鉴定导致蛋白质不能相互作用的突变 鉴定能破坏蛋白质相互作用的因子 采用反式选择性报告基因 Ure3基因编码的酶催化嘧啶类似物5-氟 清酸转化成细胞毒性物质，使细胞死亡 两种蛋白质能相互作用，Ure3基因表达， 细胞死亡 两种蛋白质不能相互作用，Ure3基因不 能表达，细胞得以生长
（一）、酵母双杂交技术原理
酵母双杂交系统的建立基于对真核生物转 录激活因子结构与功能的认识
真核生物转录激活因子 DNA结合结构域 转录激活结构域 AD BD 组件式：结构可互相分开 功能互相独立 空间较近时表现活性 中间序列对活性无影响
N端 147AA BD
C端
213AA AD
酵母转录因子GAL4
5. 绘制蛋白质相互作用网络或图谱 双杂交系统的BD及AD质粒均接上 cDNA库，让它们随机表达蛋白 通过检测报告基因的表达可以证实一 系列崭新蛋白中两两间的相互作用 如能证实在蛋白质A-B、B-C和C-D 间都存在相互作用，据此可绘制出 A→B→C→D的蛋白间联系图谱
（四）、酵母双杂交系统的局限与发展
• 分子识别 蛋白质之间普遍存在的专一性结合作用 抗体与抗原、酶与底物、配体与受体 结合局部构像相嵌互补，必要时局部构像发生变化 局部有相应的化学基团产生足够结合力 • 分子自我装配 在特定条件下生物大分子自动装配成具有生物活性的细胞器 或病毒 蛋白质、核酸、糖装配成核糖体 • 多酶体 相关的酶彼此有机的结合在一起 丙酮酸脱氢酶：丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酸乙酰转移酶、二 氢硫辛酸脱氢酶
1. Ampr基因-大肠杆菌筛 选标记 2. Trp、Leu-酵母筛选标 记 3. ３ X与BD以融合蛋白形 式表达，Y与AD以融合 蛋白表达 pGBT9质粒 pGAD424质粒
报告基因 在GAL4结合的顺式作用元件下游需 连接报告基因。 目前应用最多的报告基因是LacZ基 因，表达后能在X-Gal培养基上产生蓝色 菌落。 其次是His基因，表达后能使酵母菌 在缺少组氨酸的培养基中生长。 现在多提倡两种报告基因同时应用， 颜色筛选和营养缺陷筛选同时进行，以 降低假阳性的出现
三、噬菌体表面显示技术-筛选结合结构域
技术建立的原理和条件： 1.抗原抗体反应 抗原抗体特异性反应通过抗原决定簇实现 抗原决定簇位于分子表面，5-7氨基酸组成 2.多肽在噬菌体表面有独立活性 3.多肽化学合成技术的日趋成熟
丝状噬菌体特点： 基因组是单链DNA,只能感染F＋细菌 复制形式是双链，可用于基因操作和转化 有5种结构蛋白： PⅢ通过与F菌毛结合感染细菌 PⅧ与噬菌体的成熟和稳定有关
8X4=32密码 终止密码ＴＡＧ 第三个硷基不用A:不出现TAA和TGA 都有简并密码 第三个碱基：Ａ和Ｇ是简分（NNK)6，N:等量4种碱基 K:等量G/T两种碱基 两侧加酶切位点 经PCR扩增 酶切合成的基因片段 （2）载体酶切，与合成基因重组，转化 （3）细菌培养 （4）在培养液中收集噬菌体颗粒
（二）合成编码随机短肽的核苷酸序列： （NNK）x或（NNS）x N=A、T、C、G K=G、T S=G、C x=氨基酸数 NNK或NNS组成32个密码代表20种氨基酸 和一个终止密码TAG 第三个硷基不用A:不出现TAA和TGA 都是简并密码 第三硷基用C或T :互为简并密码
AAG T ATG T AGG T ACG T
黑龙江省重点学科检查汇报 蛋白质组学主要研究技术
刘兴汉
哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室 哈尔滨医科大学 省部共建国家重点实验室培育基地— 生物化学与分子生物学学科 黑龙江省生物医药工程重点实验室
人类基因组计划结束给科学工作者极大鼓舞，同时也引 出了更多的问题： 大量涌现出的新基因，它们有什么功能？编码什么蛋白？ 在生命过程中发挥什么样的作用？ 这些问题靠传统的研究方法不可能解决。蛋白质组 （proteome）和蛋白质组学（proteomics）的概念就是在这 个基础上提出的。 1994年9月在意大利Marc Wilkins正式提出了蛋白质组 （proteome）的概念。用于指代特定时间一个基因组或者一 种组织产生并利用的所有蛋白质。
Ｌｅｕ筛选
Trp、Leu、His 蓝色菌落 X和Y蛋白相互作用
X基因与DNA-BD质粒重组
Y基因与DNA-AD质粒重组 分别转化大肠杆菌
Amp培养基 X-BD重组质粒 Y-AD重组质粒
共转化酵母细胞
Trp和Leu营养缺陷培养基 Trp、Leu、His营养缺陷培养基
X-gal
蓝色菌落
无菌落生长
X和Y蛋白相互作用
分析结构和功能
四、酵母双杂交技术-蛋白质相互作用
一、酵母双杂交系统的原理 二、酵母双杂交系统的操作程序 三、酵母双杂交系统的应用 四、酵母双杂交系统的局限与发展
酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system） 也叫相互作用陷阱 （Interaction trap） 由Fields和Song于1989年建立 用于研究细胞内蛋白质与蛋白质间的 相互作用。
• 蛋白质功能确定： 研究蛋白质的功能，蛋白质相互作用 酵母杂交技术 噬菌体展示技术 RNA干扰技术
• 蛋白质功能研究： 噬菌体表面展示技术(phage surface display) 酵母杂交技术（yeast hybridization） RNA干扰技术 • 蛋白质鉴定 双向电泳技术 质谱分析技术
酵母双杂交系统的发展
1. 哺乳动物细胞双杂交系统 主要增强蛋白质翻译后的修饰作用， 用于检测在酵母细胞中修饰不完全的蛋 白之间的相互作用 单纯疱疹病毒BP16编码区取代GAL4 的AD结构域 氯霉素乙酰转移酶或荧光素酶为报 告基因
2. 细菌双杂交系统 直接在细胞质内研究蛋白之间相互作 用，适用于不能进入细胞核的蛋白质。 百日咳博代杆菌中腺苷酸环化酶催化结 构域可分为T18和T25两个相对独立的功能 单位
蛋白质相互作用的研究技术
• 蛋白质：结构蛋白 功能蛋白 • 生命基本过程是功能蛋白质在时空上 有序和协调作用的结果 • 从研究单一蛋白质的结构与功能关系 发展为研究蛋白质间的相互作用
一、蛋白质相互作用的种类
• 分子或亚基的聚合 四级结构蛋白质亚基间的互相聚合 聚合的亚基是固定不变的 聚合靠氢键、疏水作用力等次级键 • 分子杂交 同工酶亚基间的聚合 聚合的亚基是可变的 聚合靠次级键
多肽种类=206,肽库必须足够大
肽库的筛选
受体蛋白
生物素标记
生物素—受体蛋白 噬菌体肽库 滴定板微量 生物素—受体蛋白—多肽噬菌体 链亲和素
生物素—受体蛋白—多肽噬菌体
链亲和素 滴定板 洗去未结合噬菌体
酸洗脱
插入特定多肽的噬菌体
•
鉴
定
插入特定多肽噬菌体 提DNA 测序 由DNA序列推测多肽氨基酸序列 合成多肽
3. 确定蛋白质之间相互作用的结构域或活 性区 将一个蛋白质突变或缺失掉不同的片 段，再检测两种蛋白质在双杂交系统中 还能否保持转录激活作用，从而确定蛋 白之间相互作用的结构域或活性区。 4. 筛选多肽类新药 将药物作用的靶蛋白基因克隆在BD载 体上，待筛选的多肽药物基因克隆在AD载 体上，从中筛选作用于靶蛋白的多肽类新药
二、蛋白质间作用力
• 氢键 主链氢键：二级结构 侧链氢键：三、四级结构 表面氢键: 蛋白质间作用 • 离子键 正电荷与负电荷间的静电引力 酸性氨基酸和碱性氨基酸多在球形蛋白质的表面， 解离的带电基团互相吸引 和溶液的盐浓度有关