可卡因
抗 体 酶 水解
筛选 免疫动物 产生抗体
催化可卡因水解的抗体酶的制备
过渡态稳定的化学机制
与酶催化相关联的过渡态稳定是酶活性中心结构和 反应性以及活性中心与结合底物之间的相互作用的 必然结果。酶充分使用一系列的化学机制来实现过 渡态的稳定并由此加速反应。它们包括： 邻近定向效应 广义的酸碱催化 静电催化 金属催化 共价催化 底物形变
溶菌酶催化中的底物形变
O
O
+
H H H3 3C C
O
O H O NH O C H H C H H H
H 机制
肽键水解在热力学上是十分有利的，但若无蛋白酶的催化，1 个肽键在中性pH和25℃条件下约需300~600年的时间才能完 成水解。 根据活性中心催化基团的性质，蛋白酶可分为四类：（1）丝 氨酸蛋白酶——此类蛋白酶的催化基团包括1个不可缺少的 Ser残基，DIFP是它们的不可逆抑制剂；（2）金属蛋白酶— —这类蛋白酶在活性中心结合有金属离子，其活性绝对需要 金属离子，故金属离子螯合剂可导致活性的丧失；（3）天冬 氨酸蛋白酶——其催化基团包括2个Asp，在偏碱性的pH下无 活性；（4）巯基蛋白酶——其催化基团包括1个Cys的巯基， 碘代乙酸为它们的不可逆抑制剂。 所有蛋白酶在催化中都经历四面体的过渡态，该过渡态形成 的原因是反应涉及一个亲核基团进攻肽键的羰基碳。若是丝 氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶，进攻的亲核基团分别是Ser残基的 羟基和Cys残基的巯基，否则就是水分子。
丝氨酸蛋白酶
这类蛋白酶以一个特定的Ser残基作为必需的催化基团，属 于该家族成员的有胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、枯 草杆菌蛋白酶、激肽释放酶原、凝血酶、纤溶酶等。 丝氨酸蛋白酶的催化机制属于共价催化和广义酸碱催化的 混合体，还有氧阴离子穴对过渡态的稳定，由3个不变的 Ser、His和Asp残基构成的催化三元体起主导作用，这3个 氨基酸任何一种突变或修饰均可导致酶活性的丧失。 构成催化三元体的3个氨基酸在催化中的具体功能是：
过渡态稳定学说
HA-HB + HC→HA-HB-HC（过渡态）→HB-HC + HA 根据过渡态理论，在任何一 个化学反应体系中，反应物 需要到达一个特定的高能状 态以后才能发生反应。这种 不稳定的高能状态被称为过 渡态。达到过渡态要求反应 物必须含有足够的能量以克 服活化能。 1946年Pauling 提出，酶与 过渡态的亲和力要比对基态 （底物）的亲和力高得多， 酶的催化源于其对过渡态的 稳定作用。
广义的酸碱催化
广义的酸碱催化是指水分子以外的分子作为质子供体 或受体参与催化，这种机制参与绝大多数酶的催化。 蛋白质分子上的某些侧链基团（如Asp、Glu和His） 可以提供质子并将质子转移到反应的过渡态中间物而 达到稳定过渡态的效果。如果一个侧链基团的pKa值 接近7，那么该侧链基团就可能是最有效的广义的酸 碱催化剂。His残基的咪唑基就是这样的基团，因此 它作为很多酶的催化残基。
① ② ③ ④ ⑤
碳酸酐酶的金属催化机制
共价催化
共价催化是指酶在催化过程中必须与底物上的 某些基团暂时形成不稳定的共价中间物的一种 催化方式。许多氨基酸残基的侧链可作为共价 催化剂，例如Lys、His、Cys、Asp、Glu、Ser 或Thr，此外，一些辅酶或辅基也可以作为共 价催化剂，例如硫胺素焦磷酸（TPP）和磷酸 吡哆醛。
几种酶的共价催化
亲核共价修饰反应
乙酰乙酸脱羧酶的亲核催化
磷酸吡哆醛的亲电催化
底物形变
底物形变是指当酶与底物相遇时，酶分子诱 导底物分子内敏感键更加敏感，产生“电子 张力”发生形变，比较接近它的过渡态。 溶菌酶也利用这种方式进行催化：与溶菌酶 活性中心结合的6碳糖在溶菌酶的诱导下，从 椅式构象变成半椅式构象而发生形变，周围 的糖苷键更容易发生断裂。
第十章 酶的催化机制
提纲
一、酶催化机理研究的主要方法 二、过渡态稳定学说 三、过渡态稳定的化学机制
1. 2. 3. 4. 5. 6. 邻近定向效应 广义的酸碱催化 静电催化 金属催化 共价催化 底物形变
四、几种常见酶的结构与功能
1. 蛋白酶 2. 溶菌酶
酶催化机理研究的主要方法
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 找出保守性的氨基酸残基 三维结构的研究 定点突变 动力学分析 化学修饰 计算机模拟
① ② ③ ④ ⑤ ⑥
邻近定向效应
邻近定向效应是指两种或两种以上的底物（特别 是双底物）同时结合在酶活性中心上，相互靠近 （邻近） ，并采取正确的空间取向（定向） ， 这样大大提高了底物的有效浓度，使分子间反应 近似分子内反应从而加快了反应速度。 底物与活性中心的结合不仅使底物与酶催化基团 或其它底物接触，而且强行“冻结”了底物的某 些化学建的平动和转动，促使它们采取正确的方 向，有利于键的形成。
溶菌酶Asp52的静电催化
Glu35和Asp52 分别所起的广 义酸催化和静 电催化，解释 了溶菌酶的活 性与pH之间的 关系以及它的 最适pH
pH对溶菌酶活性的影响
金属催化
近三分之一酶的活性需要金属离子的存在，这些酶分 为两类，一类为金属酶，另一类为金属激活酶。前者 含有紧密结合的金属离子，多数为过渡金属，如Fe2+ 、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+或Co3+，后者与溶液中的金 属离子松散地结合，通常是碱金属或碱土金属，例如 Na+、K+、Mg2+或Ca2+。 金属离子以5种方式参与催化： 作为Lewis酸起作用 与底物结合，促进底物在反应中正确定向 作为亲电催化剂，稳定过渡态中间物上的电荷 通过价态的可逆变化，作为电子受体或电子供体参与 氧化还原反应 酶结构的一部分
广义的酸催化
广义的碱催化
广义的酸、碱催化
pH 和缓冲溶液浓度对特定酸碱催化和广义酸碱催化的影响
溶菌酶Glu35的广义酸催化
核糖核酸酶A的广义酸碱催化
静电催化
活性中心电荷的分布可用来稳定酶促反应的过 渡态，酶使用自身带电基团去中和一个反应过 渡态形成时产生的相反电荷而进行的催化称为 静电催化。 有时，酶通过与底物的静电作用将底物引入到 活性中心。
化学反应的过渡态及 其前后的自由能变化
“铁丝酶”催化反应的过渡态稳定机制
支持过渡态稳定学说的证据
根据过渡态的结构设计的过渡态类似物可作 为酶的强抑制剂，抑制效果远高于竞争性抑 制剂。 利用过渡态类似物作为抗原或半抗原，去免 疫动物，由此产生的抗体可能有类似酶的催 化作用。
脯氨酸消旋酶的过渡态及其过渡态类似物抑制剂