需RNA引物
不需要引物
特点
半保留复制
不对称转录
RNA合成的检测
• TCA(三氯醋酸)沉淀法：反应体系包括 DNA模板，RNA聚合酶，NTPs，用放射 性同位素至少标记一种NTP前体，保温一 段时间以后加入TCA，RNA不溶于TCA而 生成沉淀，而反应各组分不形成沉淀，然后 用滤纸过滤，在滤纸上的放射性强度和合成 的RNA量成正比。
复制和转录的异同点
相同点： 1.以DNA为模板 2.合成新链的方向均为5’→3’
3.都需要依赖DNA的聚合酶
4.遵守碱基互补配对规则
不同点 模板 原料 聚合酶
复制 两股链均作为模板 dNTP DNA聚合酶
转录 模板链作为模板 NTP RNA聚合酶
mRNA, tRNA, rRNA
产物
引物
子代DNA双链
RNA合成的起始
一般情况下，转录起始复合物可以进入两 条不同的反应途径： 合成并释放2-9个核苷酸的短RNA转录物， 即所谓的流产式起始； 尽快释放σ亚基，转录起始复合物通过上游 启动子区并生成由核心酶、DNA和新生 RNA所组成的转录延伸复合物。
转录延伸复合物较为稳定，可长时间与 DNA模板结合而不解离。只有在遇到转 录终止信号时，RNA聚合酶才停止加入 新的核苷酸，RNA-DNA杂合物解离， 释放转录产物并导致聚合酶本身从模板 DNA上脱落。
大肠杆菌RNA聚合酶核心酶单独合成RNA
a
b’
Active center cleft
a
w
b
真核生物RNA聚合酶 真核生物中有3类RNA聚合酶，其结构比 大肠杆菌RNA聚合酶复杂，它们在细胞核 中的位置不同，负责转录的基因不同，对 α-鹅膏覃碱的敏感性也不同。 真核生物RNA聚合酶一般有8-14个亚基所 组成，相对分子质量超过5×105。
RNA聚合酶
rNTP+XTP
DNA， Mg2+
（NMP）n-XTP+nPPi
④ 聚合反应需要Mg2+或Mn2+离子。 ⑤ 不需要任何引物。RNA聚合酶缺乏3’→5’ 外切酶活性，所以没有校正功能。
RNA或RNA-DNA双链杂合体不能 作为模板。 原核和真核生物的RNA聚合酶虽然都 能催化RNA的合成，但在其分子组成、 种类和生化特性上各有特色。
–35区 –10区 ……T85T83G81A61C69A52……T89A89T50A65A100……
典型原核启动子的四大要素
• -10区：是一个6碱基保守序列（常以-10为中心） TATAAT，有助于DNA的解链，称为Pribnow 盒或者TATA盒 • -35区：是另一个6碱基保守序列（常以-35为中 心）TTGACA • 转录起始位点：+1号位，通常是嘌呤，其序列通 常为CAT • -10区与-35区的间距：大约16-19bp，小于 15bp或者大于20bp都会降低启动子活性
σ因子不仅增加聚合酶对启动子的亲和力，还并与启 动子区的特异性序列相结合
因子
σ70
基因
rpoD
功能
广泛
-35区
TTGACA
间隔 （bp）
16-18
-10区
TATAAT
σ32
σ54
rpoH
rpoN
热休克 TCTCNCCCT 13-15 CCCCAT TGAA NTA
• 体外转录实验表明，用核心酶催化转录时 RNA聚合酶对模板链和起始位点的选择都 有很大的随意性。
• 核心酶与DNA有一定的亲和力，来自蛋白 质的碱性基团与DNA磷酸根之间的静电引 力，是一种与DNA序列无关的非特异性结 合，称为松弛结合。
σ因子可以极大地提高RNA聚合酶对启动子区 DNA序列的亲和力，酶底结合常数提高103倍， 酶底复合物的半衰期可达数小时甚至数十小时。 σ因子还能使RNA聚合酶与模板DNA上非特异 性位点的结合常数降低104倍，使酶底复合物的 半衰期小于1秒。
图3-6 大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区
原核生物启动子的共同序列
在真核生物基因中，Hogness等发现类似 Pribnow区的Hogness区，在转录起始点 上游–25～–30 bp处，保守序列为 TATAAA，也称TATA区。在起始位点上游– 70～–78 bp处还有另一段共同序列 CCAAT，称为CAAT区（CAAT box）。
功能 识别起始点，稳定全酶 转录的特异性
亚基 β ' β σ α
α，β，β’和σ亚基分别由rpoA，rpoB，rpoC和 rpoD编码 另外一个重要的亚基NusA
α亚基可能与核心酶的组装及启动子 识别有关，并参与RNA聚合酶和部分 调节因子的相互作用。
T4噬菌体感染大肠杆菌后对α亚基的 一个精氨酸残基进行ADP糖基化修饰， 造成RNA聚合酶全酶对启动子亲和力 降低。
3.2.启动子与转录起始 大肠杆菌RNA聚合酶与启动子的相 互作用主要包括启动子区的识别、 酶与启动子的结合及σ因子的结合 与解离。
3.2.1 启动子区的基本结构
• 启动子（promoter）：是位于基因上游，与 RNA聚合酶识别、结合模板并起始转录紧密相关的 一段DNA序列。启动子一般包括识别、结合和起始 三个部位。 • 转录起点（start point）：是指与新生RNA链第 一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，通常为嘌呤 • 转录单元（transcription unit）:一段从启动子 开始至终止子结束的DNA序列。 • 转录子：两个或者两个以上的连续的基因转录在一 个mRNA分子中，这些基因所组成的复合单位称为 转录子。
RNA合成步骤
1.模板识别 2.转录起始 3.转录的延伸
4.转录的终止
大肠杆菌RNA聚合酶
• 大肠杆菌RNA聚合酶全酶由五 种类型的六条亚基构成，即 α2ββ’ωσ，成为全酶。 • σ亚基与转录起始点的识别有关， 而在转录合成开始后被释放， 余下的部分α2ββ’ω被称为核心酶， 与RNA链的聚合有关。 • 在核心酶中，ββ’两个亚基构成 了聚合酶的催化中心，原核和 与模板 DNA 真核生物中的这两个亚基在序 结合 起始和催化合成 列上具有同源性。
RNA聚合酶、DNA、新生 RNA构成稳定的三元复合物 （stable ternary complex）
真核生物的转录起始较为复 杂。目前已知RNA聚合酶Ⅱ 至少有七种不同的蛋白辅助 因子参与转录起始复合体的 形成。这些蛋白因子被称为 转录因子（transcriptional factor，TF）。TF包括 TFⅡA，TFⅡB，TFⅡD， TFⅡE，TFⅡF，TFⅡH， TBP等。
启动子功能的研究方法----启动子的突变
科学家又从噬菌体的左、右启动子PL及PR和 SV40启动子的–35 bp附近找到了另一段共 同序列：TTGACA。
现已证实大部分启动子都存在这两段共同序列， 即位于–10 bp处的TATA区和–35 bp处的 TTGACA区，它们是RNA聚合酶与启动子的 结合位点，能与σ因子互相识别而具有很高的 亲和力。
表3-2 真核细胞中三类RNA聚合酶特性比较
线粒体RNA聚合酶只有一条多肽链，是 已知最小的RNA聚合酶之一。
叶绿体RNA聚合酶比较大，结构与细菌 的RNA聚合酶相似。
• 和原核生物一样，真核生物RNA聚合酶也 需要有蛋白质辅助因子的协助。非洲爪蟾的 RNA polIII在转录5S RNA的时候，需 要一种分子量为37kDa的蛋白质因子
Confers additional specificity
上游元件（UP-element）为RNA聚合酶 提供另一个作用位点从而增强DNA与RNA 聚合酶的结合
另一类σ70 的启动子缺少-35区，但是 在-10区上游含有一个额外的-10元件
由β和β’亚基组成了聚合酶的催化中心， 它们在序列上与真核生物RNA聚合酶的 两个大亚基有同源性。 β亚基是RNA聚合酶的催化亚基，能与模 板DNA、新生RNA链及核苷酸底物相 结合。
利福平和链霉素能够抑制转录，前者抑 制RNA合成的起始，后者抑制RNA链的 延伸。
离体实验中，肝素（heparin）能抑制 转录，肝素与β’亚基紧密结合， β’亚基 是碱性最强的亚基，肝素是一种酸性的 粘多糖，它与DNA竞争与β’亚基从而妨 碍β’亚基与有意链的结合。
replication
3. 1. 2 转录机器的主要成分 1. RNA聚合酶(DDRP)
• 真核和原核细胞内都存在有DDRP，迄今发现的DDRP 的有以下特点： • ① 以双链DNA为模板 • ② 需要4种NTP作为底物，DNA与RNA之间遵循碱基 互补原则，A=U，T=A，C=G。 • ③ 催化RNA链的起始、延伸和终止，RNA链的延伸方 向是5’→3’ ，NTP加到新生RNA链的3’ 端，形成磷酸 二酯键。
RNA聚合酶亚基
prokaryotic a
b’ b
a w eukaryotic
RPB3
相同颜色代表两物种 RNA聚合酶的同源亚 基
RPB2
RPB11
RPB6
RPB1
2.转录复合物
RNA聚合酶与启动子可逆性 结合形成封闭复合物 （closed complexes）
DNA解链形成开放性复合物 （open complexes）
原核生物的启动子
The distance is conserved
1. σ70含有可识别的-35区和-10区
2. 不同启动子在-35区和-10区含有保守序列
-35区和-10区的保守序列
• 启动子区含有的序列越接近保守序列，启动 子越强（为什么？） • 启动子的强弱程度由规定时间内能够起始转 录的多少决定
RNA聚合酶是原核生物转录过程的核心部 分。除了RNA聚合酶外，转录还需要其他 一些蛋白质辅助因子。例如转录终止时的释 放因子（ρ 因子）和抗终止因子等。 σ因子习惯上作为RNA聚合酶的组成成分， 实际上也是一种辅助因子。