乳酸链球菌素的生产及研究现状吴江乳酸链球菌素(Nisin) 是从乳酸链球菌发酵产物中提制的一种多肽抗菌素类物质,是一种世界公认的安全的天然生物性食品防腐剂和抗菌剂。
1944 年Mattick 和Hirsch 发现血清学N 群中的一些乳酸链球菌能产生蛋白类抑菌物质,命名为N-inhibitory Substance 即N 群抑菌物质,简称为Nisin。
1953 年由英国的阿普林和巴雷特公司首次以商品的形式出售了这种新的防腐剂———乳酸链球菌素。
1969 年,FAO/ WHO 食品添加剂联合专家委员会批准Nisin作为一种生物型防腐剂应用于食品工业。
1988 年美国食品和药物管理局(FDA) 也正式批准将Nisin应用于食品中。
我国在GB2760 —86 中批准Nisin可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品、肉制品中。
迄今为止,Nisin 已在全世界约60 多个国家和地区被用作防腐剂。
1.乳酸链球菌素的生产1.1 菌种的筛选和改良乳酸链球菌广泛存在于天然牛奶及乳酪和酸奶中, 从牛奶场取生牛奶样品, 加以稀释, 然后在含有检测菌及吐温20 为扩散剂的固体检测培养基表面进行涂布, 在30 ℃培养24h 后, 测量抑菌圈直径, 挑取抑菌圈直径与菌落直径比较大的菌株再进行平板划线分离, 选取单个菌落接至试管斜面保存, 然后, 逐一测定菌株的Nisin 效价。
这样便筛选出产Nisin 的乳酸链球菌菌株。
若想获取高产菌株, 可对原始菌株再进行诱变处理。
1.2 培养基和培养条件不同的乳酸链球菌株,其Nisin 的效价也有显著的变化,所适应的发酵条件也各有所不同,国内外这方面的研究较多,综合来看,在C 源上,最适合的主要为蔗糖和可溶性淀粉,其添加量随菌株的不同也各有所不同。
最适N 源,主要为酵母膏,添加量1 %左右,另外酵母膏及吐温80对细胞的生长及Nisin 的产生均有利。
最适P 源普遍认为KH2PO4最合适,添加量一般≤5 % ,使用KH2PO4主要有两方面优点:即可创造良好的pH 环境;可提高Nisin 的产生。
有研究表明,Nisin 的高效价在很大程度上也依赖于S 源的存在,添加无机盐类如硫酸镁、硫代硫酸盐或含硫氨基酸如蛋氨酸、半胱氨酸等,均有较好效果。
在近几年所有的报道中,最适发酵温度均为30 ℃左右,最适pH为5.0～5.5或6.5左右。
1.3 分离纯化目前,采用的方法一般为将NaCl 饱和的乳酸链球菌发酵液经正丙醇提取2次,再用丙酮沉淀可得到乳酸菌肽粗制品, 将粗制品溶于0.05mol/ l HAC -NaAc(pH3.6) 缓冲液,并用缓冲液透析24h ,离心后经柱层析,可使Nisin 的效价及纯度大大提高,再经喷雾干燥、研细及用NaCl 调整成分,即可制成Nisin 成品。
2.豆粕发酵生产乳酸链球菌的试验培养条件对Nisin生产的影响有研究证明豆粕发酵生产试验中，蔗糖为乳酸链球菌发酵的最佳碳源, K2HPO4 对发酵也有促进作用。
通过单因素实验、正交实验,优化了豆粕发酵的培养基组成,其最优配方为:每100 g豆粕添加麸皮2g、蔗糖1.8g、酵母膏1.2g、K2HPO41.5g、NaCl0.1g、MgSO40.03g,水100g,其生物量达到0.94IU/g,Nisin最高效价达到997IU/g。
2. 1 不同培养基对Nisin产生的影响分别接种乳酸链球菌WX506种子液于MRS、LB、M17、CM四种发酵培养基中, 30℃, 200 r/min摇床培养, 24 h后测定发酵液效价、pH值和生物量(OD 600 nm) 。
结果证明，MRS培养基虽然有利于菌体生长,但Nisin效价远不如CM培养基,因此,我们选择以CM培养基作为对照,优化豆粕培养基的组成。
2. 2 添加麸皮对豆粕发酵的影响由于乳酸链球菌WX506为兼性厌氧微生物,添加麸皮能增加豆粕间隙,有利于菌体生长。
结果证明，添加2 g麸皮的Nisin产量最高, 4g麸皮的菌体生长最好。
2. 3 碳源对豆粕发酵的影响豆粕中虽然含有少量糖分,但是远不能满足微生物生长需要。
以豆粕为基础,添加不同的碳源进行发酵(每100g豆粕添加1g) ,以豆粕发酵作为对照。
结果可知,补加葡萄糖最有利于菌体生长,补加蔗糖产Nisin效果最好。
其原因可能是菌株WX506和其它产生乳链菌肽的乳酸链球菌一样,编码乳链菌肽前体的结构基因与蔗糖发酵基因紧密连锁在一起,而且有一个有效的磷酸烯醇式丙酮酸依赖型磷酸转移酶系统作为蔗糖的吸收、运输及代谢的途径。
2. 4 蔗糖对豆粕发酵的影响从图2可以看出,补加1.5g的蔗糖效价较高,补加量再增时,效价降低,同时过高的蔗糖浓度对Nisin产生有抑制作用,所以,100g豆粕补加1.5g的蔗糖比较合适。
2. 5 磷源对豆粕发酵的影响通常认为磷酸盐的主要作用是由于它们具有较强的缓冲能力,能够缓冲在发酵过程中由于乳酸的产生而造成的培养基pH值下降,从而有利于Nisin的产生。
以豆粕发酵培养基为基础,在100g豆粕中添加2g麸皮、1.5g蔗糖、1g酵母膏的前提下,添加1g的不同的磷源进行发酵。
结果可知,所选用的几种磷酸盐都较好的促进了Nisin的产生,其中以K2HPO4为最好。
2. 6 K2HPO4 对豆粕发酵的影响以豆粕发酵培养基为基础,在100g豆粕中添加2g麸皮、1.5g蔗糖、1g酵母膏,添加不同浓度的K2HPO4 进行发酵。
结果可以看出, K2HPO4添加量在1.5g以下时,对发酵液效价有较大的影响, 对生长影响不大。
K2HPO4为1.5g时,发酵液效价达到最高值;当K2HPO4添加量超过2g或更高时,就会对Nisin合成产生一定的抑制作用,对菌体生长也有影响。
2. 7 酵母膏对豆粕发酵的影响乳酸链球菌是一类对营养要求较高的菌种,氮源可被利用的难易程度必然影响该菌的初级代谢,从而影响Nisin的产量。
另外,Nisin生产需要稀有氨基酸等生长因子,而酵母膏中含有这些生长因子,因此,在培养基中适量添加酵母膏有利于菌体生长,有利于Nisin生产。
2. 8 NaCl对豆粕发酵的影响在CM培养基中,NaCl也是一种主要的营养成分, NaCl添加量0.2g为最佳,生长量与Nisin产量均为最高,添加量超过0.4g时,效价明显降低,生长量也降低。
因此,选择添加0.2g的NaCl。
2. 9 硫酸镁对豆粕发酵的影响在以上优化的基础上,添加不同量的MgSO4对豆粕发酵菌体的生长没有明显的影响,添加0.02g的MgSO4对Nisin合成有一定的促进作用,但是添加量过高会降低Nisin的产量。
这可能是由于Mg2+可通过保护细胞质膜的完整性来增强Nisin对主要肽酶NisP的免疫力,或是降低了Nisin在细胞表面的吸附。
2. 10 吐温80的添加对豆粕发酵的影响吐温80作为一种表面活性剂,可降低细菌菌体与培养基表面之间的表面张力,能刺激多种胞外酶的产生,它也可以影响某些微生物细胞的膜通透性,促进营养物质进入细胞及代谢产物排出体外。
吐温80会促进包括Nisin在内的一些细菌素的生产, Huot等研究表明,吐温80对乳酸乳球菌J46产生的细菌素有明显的促进作用,并使发酵单位有了大幅度提高。
但在豆粕发酵试验中,添加吐温80并没有显示出明显的促进作用,相反,当吐温80添加量超过0.5ml时,反而会使生长量降低,Nisin发酵效价降低。
3. 行业发展浙江银象生物工程有限公司——全国最大的乳酸链球菌素制造商兰州伟日生物工程有限公司是一家从事生物工程，集研发、生产、销售为一体的现代高科技企业。
与浙江大学合作，主要产品—乳酸链球菌素（Nisin）.目前,世界上唯有我公司采用全物理工艺方法提取，生产过程中不使用任何有机溶剂，是真正的绿色产品.沈阳红梅企业集团——尼鲜宝（NisiNoble）牌乳酸链球菌素（Nisin）英国Aplin & Barrett公司——商品名为Nisaplin(尼萨普林)4.Nisin的应用4.1 在肉制品中的应用传统的火腿、熏肉和香肠产生中, Nisin能有效控制肉制品中微生物的生长,降低残留的亚硝酸盐的含量,减少亚硝胺的形成。
Nisin 可作为一种有效的替代物,减少火腿中发色剂的用量；可取代山梨酸钾作防腐剂,并能提高产品质量。
4.2 在乳制品中的应用Nisin 可用于巴氏灭菌牛奶,添加量为30～50mg/ kg ,通常在35 ℃下产品货架期可延长一倍; UHT 奶中添加20mg/ kg 的Nisin ,能完全抑制灭菌乳中嗜热细菌芽孢的生长，而且感官质量良好。
4.3 在罐头制品中的应用Nisin 在酸性条件下易溶、稳定、抑菌活力也高,因此可用于高酸性(pH 4. 6) 罐头的保鲜。
如西红柿罐头和低酸性(pH 4. 6) 罐头如马铃薯、蘑菇、水果罐头中,添加适量Nisin ,可以有效地抑制芽孢的生长,保持其新鲜度,并延长保存期。
4.4 在酱菜中的应用目前,各类酱菜中含盐量偏高,约在10～20 %之间,但高盐食品易诱发高血压等疾病。
加入100mg/ kgNisin ,可抑制杂菌生长,并使盐的浓度下降为7～9 %。
由于一些国家在食品中不准使用苯甲酸钠,所以Nisin 用于瓶装酱菜出口,具有现实意义。
4.5 在酒精饮料中的应用腐败乳酸菌对Nisin 敏感,但酵母几乎不受其影响。
因此,Nisin 可与酵母一起在生产啤酒、果酒、烈性乙醇等酒精饮料时加入,用来抑制G+ 菌。
啤酒常见腐败菌几乎均能被100IU/ ml Nisin 所抑制,并能延长啤酒,尤其是非巴氏灭菌和瓶装啤酒的货架期；把Nisin 应用于白酒酿造中,有效地阻碍了肠膜状明串珠菌,啤酒片球菌和乳酸杆菌的生长,防止了杂菌的污染。