蓝莓组织培养技术介绍组培介绍一、组培的概念和重要性（一）.植物组织培养的含义（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
（狭义）组培指用植物各部分组织，如形成层.薄壁组织.叶肉组织.胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
（二）、植物组织培养的重要意义：1. 加速无性繁殖;2. 获取脱毒苗;3. 扩大变异范围：(1)克服远缘杂交后代不育性和杂交不亲和性。
(2)通过原生质体融合获得体细胞杂种和胞质杂种。
(3)倍性育种：通过胚乳培养获得三倍体；通过花粉和花药培养进行单倍体育种。
(4)结合诱变育种在试管内进行优良变异的诱导.选择和繁殖。
4.加速亲本材料的纯化。
一般选育自交系需4－6代花粉培养获得单倍体植株，染色体加倍后即为纯合二倍体。
5.种质资源的试管保存。
6.为基因工程的全面实施人工控制遗传方向打下基础。
二、植物组织培养的理论依据（一）植物细胞的全能性指每个植物细胞都具有形成完整植株的能力，因为每个细胞都具有全套的遗传基因，无论是性细胞还是体细胞在特定条件下可以进行表达。
1902年德国植物生理学家Haberlandt提出了“细胞的全能性”原理。
但在当时的技术条件下，在实践上并没做到，经过几十年来组织培养技术的不断改进，目前细胞的全能性不但在理论上完全被证实，而且为组织培养在实践上的应用奠定了基础。
（二）植物细胞要表现出全能性，须经过几个步骤：成熟细胞(外植体)→分生细胞→胚状体→完整植株。
成熟细胞(外植体)→愈伤组织→出根出芽→完整植株。
成熟细胞(外植体)→诱导侧芽生长→出根出芽→完整植株。
脱分化也就是已经分化定型的细胞，经过诱导成为重新恢复了分裂能力（也就是成为分生状态）细胞的过程。
不但植物体细胞可以表现全能性，花粉在培养条件下也可能进行脱分化，通过愈伤组织或胚状体发育成单倍体植株。
三、植物组织培养的理论依据（一）植物细胞的全能性指每个植物细胞都具有形成完整植株的能力，因为每个细胞都具有全套的遗传基因，无论是性细胞还是体细胞在特定条件下可以进行表达。
1902年德国植物生理学家Haberlandt提出了“细胞的全能性”原理。
但在当时的技术条件下，在实践上并没做到，经过几十年来组织培养技术的不断改进，目前细胞的全能性不但在理论上完全被证实，而且为组织培养在实践上的应用奠定了基础。
（二）植物细胞要表现出全能性，须经过几个步骤：成熟细胞(外植体)→分生细胞→胚状体→完整植株。
成熟细胞(外植体)→愈伤组织→出根出芽→完整植株。
成熟细胞(外植体)→诱导侧芽生长→出根出芽→完整植株。
脱分化也就是已经分化定型的细胞，经过诱导成为重新恢复了分裂能力（也就是成为分生状态）细胞的过程。
不但植物体细胞可以表现全能性，花粉在培养条件下也可能进行脱分化，通过愈伤组织或胚状体发育成单倍体植株。
四、植物组织培养的应用1.无性系快速繁殖:应用组织培养和细胞培养技术,快速繁衍珍稀濒危植物,使物种得以保存;以及快速繁殖名优新品种,使其在一定时间内繁衍为一定数量的植株。
2.花药培养和花粉单倍体育种:离体花药--花粉培养的单倍体育种法,与常规方法相比,可以在短时间内得到作物的纯系,从而加快育种过程.据不完全统计,我国各地用花药或花粉培育出的植物已有22科52属160个种,取得了较大的成就。
3.药用植物的工厂化生产:当前各地采用组织培养来加速药用植物(如人参、紫草、贝母、三分三、甘草等)的繁殖生长已获得成功，并投入工厂化生产。
4.种质的保存和基因库的建立：组织培养材料的体积小，利于在低温（如低温冰箱）或超低温（如液态氮）中长期保存。
5.突变体的筛选培育：在组培进程中，基因型易发生变异，人们采用紫外线、X射线、r 射线、对培养物照射，或者在培养基中加入叠氮化合物等，以诱导和提高突变频率，产生人们需要的突变体，供人们筛选培育。
蓝莓组培一、实验室设计1.准备室:(1)进行药品的保存、配置、消毒、分装等。
(2)器具的洗涤、干燥、消毒。
(3)生理生化指标的测定等。
2.接种室：进行材料的接种，内置超净工作台或接种箱。
外设缓冲间-放置拖鞋、工作服、工作帽等。
3.培养室：植物材料的无菌培养，室内主要有培养架和控制温度及光照的设备。
4.细胞学观察实验室：进行培养材料的组织学、细胞学、观察照相等。
二、常用设备和器材1.高压蒸气灭菌锅：用于培养基、蒸馏水和接种器械的灭菌消毒。
2.超菌工作台：用于培养物的无菌操作。
（由鼓风机、滤板、操作台、紫外灯和照明灯组成）3.接种工具：包括双筒实体显微镜、镊子、剪刀、解剖刀、洒精灯等。
4.培养设备：包括空调机、定时器、温度控制器、增湿机或去湿机、培养架、摇床或旋转床、日光灯、光照培养箱等。
5.化学实验及分析设备：包括天平、酸度计、蒸馏水器、烘箱或玻璃仪器烘干器、电炉、药品柜、冰箱、晾干架等高压灭菌锅手提式灭菌锅培养箱超净工作台烘干箱电子天秤三、玻璃器皿的选择和清洗1.玻璃器皿的选择*试管- 适合于用少量培养基及试验各种不同配方时选用。
*三角锥瓶- 适用于各种培养（如固体培养、液体培养、大规模培养或一般培养）。
*L形管和T形管- 为专用的旋转式液体培养试管。
*培养皿- 适于作单细胞的固体平板培养、胚和花药培养和无菌发芽。
*角形培养瓶和圆形培养瓶- 适用于液体培养用，如单细胞和原生质体的浅层培养。
*果酱瓶- 常用作试管苗大量繁殖用的培养瓶。
2.玻璃器皿的清洗（1）清洗玻璃器皿用的洗涤剂有肥皂、洗洁精、洗衣粉、和铬酸钾洗涤液。
（2）清洗时先将器皿中的残渣除去，用清水洗净，再用热的肥皂水或洗洁精洗净，清水冲洗干净后用蒸馏水冲洗一次，干后备用。
（3）洗净的玻璃器皿应透明发亮、内外壁水膜均匀，不挂水珠。
四、影响植物组培的因素1.植物因素：(1)基因型，(2)植物年龄，(3)组织和器官的年龄，(4)植物的生理状态，(5)取材年份及生长条件，(6)取材部位及大小。
2.培养基因素：无机盐、有机化合物、植物激素、天然提取物、琼脂、PH值、渗透压、活性炭。
植物组织培养的成功与否，除了培养材料本身的因素外，很大程度上取决于对培养基的选择。
培养基的种类、成份等直接影响培养材料的生长发育。
故应根据培养材料的种类和部位，选取适宜的培养基。
3.外植体的选择和灭菌:不同品种、不同器官之间的分化能力有差别，且组织培养是建立在无菌操作基础之上的专门技术，因此在进行植物组织培养时，必须选择合适的外植体进行灭菌操作，以确保组织培养工作的顺利进行。
4.环境因素：(1)光照：包括光强、光质、光周期，(2)温度，(3)湿度，(4)气体。
五、培养基的主要成分及制作程序（一）、培养基的主要成分：1.无机盐：(1)大量元素：C.H.O.N.P.K.Ca.Mg.S.Cl。
(2)微量元素：Fe.Cu.Mo.Zn.Mn.Co.B.Na。
(3)水：培养基95%是水，应使用蒸馏水、双蒸水或使用去离子水,水应放在塑料容器中。
2.有机化合物：(1)糖(碳源和能源)，(2)维生素类：有维生素b1(盐酸硫胺素)、维生素b6(盐酸砒哆醇)、生物素、烟酸、叶酸等，(3)氨基酸类(有机氮源)。
3.植物激素（生长调节物质）：（1）生长素：主要包括IAA（吲哚乙酸）、NAA（萘乙酸）、2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、IBA（吲哚丁酸）；它们的主要作用是诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生；作用的强弱顺序为：2，4-D>NAA>IBA>IAA。
（2）细胞分裂素：天然：6-BA（6－苄基酰嘌呤）、KT（激动素，糠基酰嘌呤）；人工：ZT（玉米素）、2-iP（2-异戊烯酰嘌呤）；它们的主要作用是促进细胞的分裂和器官的分化、延缓组织的衰老、增强蛋白质的合成、抑制顶端优势、促进侧芽的生长及显著改变其他的激素作用；作用的强弱顺序为：TDZ,4PU>ZT>2-iP>6-BA>KT。
（3）赤霉素：GA3。
（4）乙烯及乙烯抑制剂。
4.天然提取物（如椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥等），其作用是提供一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素等。
5.琼脂（是从海藻中提取的一种高分子碳水化合物），其主要作用是使培养基在常温下凝固，同时不参与代谢。
6.活性炭：加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响，如可以防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。
（二）、1962年Marshing和Shong发明了MS培养基（三）、培养基的制作程序：六、外植体的选择和灭菌（一）、外植体的选择:(1)外植体部位;(2)取材季节;(3)器官和生理状态和发育年龄;(4)外植体的大小。
(二)、外植体的灭菌方法1、常用灭菌药剂的使用和效果：消毒剂使用浓度/% 清除难易消毒时间/min 灭菌效果次氯酸钠 2 易 5-30 很好次氯酸钙 9-10 易 5-30 很好漂白粉饱和溶液易 5-30 很好升汞 0.1-1 较难 2-10 最好酒精 70-75 易 0.2-2 好过氧化氢 10-12 最易 5-15 好溴水 1-2 易 2-10 很好硝酸银 1 较难 5-30 好抗菌素 4-50mg/L 中 30-60 较好2.灭菌方法:(1)茎尖、茎段及叶片等的消毒：用清洁剂清洗---75%酒精浸泡10-20min---无菌水洗2-3次---Naclo或升汞溶液泡10-15min---无菌水洗3-4次（2）果实和种子的消毒：自来水冲洗10-30min---70%酒精漂洗---2%Naclo液浸10min---无菌水2-3次---取出种子培养（3）根及地下部器官的消互毒：自来水冲洗---纯酒精漂洗---升汞浸5-10min或2%Naclo液浸10-15min---无菌水洗3次（4）花药的消毒：70%酒精浸泡数秒钟---无菌水洗2-3次---漂白粉上清液浸10min---无菌水洗2-3次。
七、外植体接种和培养1.外植体的接种（1）接种室的消毒:用70%酒精喷雾使细菌和真菌孢子随灰尘的沉降而沉降,再用紫外灯照射20min；或用高锰酸钾与甲醛蒸气熏蒸。
超净工作台可用新吉尔灭或酒精擦洗，其它一切器皿、衣物都要经严格的灭菌才能带进接种室。
（2）接种：左手拿试管或三角瓶，右手拿接种针或镊子接种，瓶口要靠近酒精灯火焰、接种动作要快，以免造成污染。
2.培养方法（1）根据外植体不同可分为：胚胎培养、器官培养、组织培养、细胞培养、原生质体培养（2）根据培养方式不同可分为：固体培养、液体培养、半固体培养、双层培养3.培养条件：温度、湿度、光照、PH值、氧和其它气体4.外植体褐变及其防止:(1)培养基中加入抗氧化剂；(2)用抗氧化剂浸泡外植体后再接种；(3)减少光照强度或在黑暗条件下培养；(4)多次更换培养基达到稀释释效应；(5)加入多胺类物质，如精胺、亚精胺通过刺激细胞分裂，加速组织生长，减少褐化。