实验二植物组织中可溶性糖的薄层层析分离与鉴定
[实验目的]
糖类是自然界存在的数量最多的有机化合物，它既是植物躯体和细胞的结构成份，又是生命活动能量的主要来源，并且与植物体内各类物质的代谢密切相关，分离鉴定植物组织中可溶性糖的种类及其变化，对了解植物体内的组织代谢和农产品的品质，具有重要意义。
本实验采用硅胶G薄层层析法，分离鉴定植物组织中可溶性糖的种类，要求通过本实验，学习提取植物材料中可溶性糖的一般方法，掌握吸附薄层层析的原理，操作及其在糖类鉴定中的作用。
[实验原理]
植物组织中的可溶性糖可用一定浓度的乙醇提取出来，经除去杂质，即可获得较纯的可溶性糖混合物。
薄层层析是层析法的一种，层析法是利用被分离样品混合物中各组分的物理、化学差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，这两个相通常使一个被固定在一定的支持物上的，称为固定相；另一个是移动的，称为流动相；当流动相流过固定相时，在移动过程中由于各组分在两相中的分配情况不同，或吸附性质不同，或电荷分布不同，或离子亲和力不同等，而以不同速度前进，从而达到分离的目的。
薄层层析是一种快速而微量的层析方法，它是将一种固定支持物均匀地涂在薄板上，对物质进行层析的方法，本实验只讨论吸附薄层层析，即所有支持物是吸附剂(如硅胶粉)，层析时，主要是根据吸附剂对样品中各组分的吸附能力不同，因此个组分的移动速度不同，从而达到分离混合物的目的。
糖为多羟基化合物，具有较强的极性，在硅胶G薄板上展层时，糖与硅胶分子有一定的吸附力。
硅胶分子与糖的吸附能力大小取决于糖的分子量和羟基数目，不同的糖分子由于分子量及羟基数的不同，因而它与硅胶分子间的吸附力不同。
造成各种糖分子在展层过程中移动的距离不同，从而将各种糖分离出来，一般吸附力的大小为：三糖>双糖>己糖>戊糖。
其中各种糖移动的速率可用Rf值表示。
通过与标准糖的Rf值比较。
即可鉴定出植物组织提取液中糖的种类。
溶质斑点中心到样点的距离：Rf( 值) = 溶剂前沿到点样点的距离
[器材与试剂]
1、材料：苹果或其他植物材料
2、仪器：离心机及离心管、天平、研钵、量筒（25ml)、移液管（10ml）、恒温水浴、毛细管、层析缸、吹风机、烘箱、喷雾器、烧杯、铅笔，尺子，硅胶GF254薄层层析板。
3、试剂
展开剂（氯仿：冰醋酸：水=30：35：5）
5%标准糖溶液(10mg/ml)：木糖，葡萄糖，果糖，蔗糖等。
显色剂：2mL苯胺，10mL 85%磷酸，2g二苯胺，1mL浓盐酸，100mL丙酮，溶解后混匀）[实验步骤]
1、硅胶板活化：将硅胶板置于120℃烘干箱中，烘干30min。
2、水果中可溶性糖提取液的制备：取洗净的苹果(或其他水果)削去果皮，称3g果肉在研钵中研成匀浆后，倒在双层洗净的纱布上。
包起置于漏斗，用干净玻璃棒将果汁压出。
取果汁1ml于离心管中，加无水乙醇3ml，充分混匀后，在3000转/分下离心20分钟，上清夜即为可溶性糖提取液。
3、苹果提取液中可溶性糖的分离鉴定：取活化后的硅胶G板一块，距底边1.5厘米水平线
上确定5个点，相互间隔1厘米，其中4个点，分别点上5%的木糖，葡萄糖，果糖，蔗糖标准溶液数滴，另一点点上苹果提取液数滴。
在用毛细管点样时，毛细管应垂直于硅胶G 板的方向点样，而且毛细管接触G板的时间应尽量短，不然点样斑点直径难以控制，点样量约20－30μL，分次滴加，使点扩散后的直径不超过3ｍｍ。
4、展层
将点样后的薄层板置于密闭的薄层层析缸中，用新配制的展开剂，采用上行法展层，至展开剂距薄层板的上端约１cm时取出，用吹风机吹干。
5、显色
把一块薄板放在通风橱内，采用苯胺－二苯胺－磷酸（2g二苯胺，加2mL苯胺，10mL 85%磷酸，1mL浓盐酸，100mL丙酮，溶解后混匀）显色剂丙酮溶液喷雾法显色，然后于85℃烘箱中烘10-30分钟，各种糖即显示出不同色斑与标准糖比较，根据斑点颜色及Rf值即可鉴定出苹果提取液中所存在的可溶性糖的种类。
显色剂处理后不同单糖显现的颜色
单糖颜色
葡萄糖蓝紫
半乳糖蓝紫
果糖橙红
木糖蓝绿
鼠李糖绿
[实验结果]
精确量出原点至溶剂前沿，以及各斑点中心的距离，计算出它们的R f值。
根据标准糖的颜色和R f值，鉴定出样品中糖的种类，并绘出层析图谱。
原点至斑点中心的距离
Ｒf＝──────────────。
原点至展开剂前沿的距离
[注意事项]
1、点样时，要注意点样点不能太大，操作时，应待第一次点样风干后，再在原点样点上继续点样，为少量多次点样。
2、每个点样点不宜距离太近，点样点不宜靠近硅胶板边缘，注意边缘效应。
3、放置硅胶板时，不能碰着层析缸的内壁。
4、在用多元系统进行展层时，其中极性较弱的和沸点较低的溶剂（例如氯仿-甲醇系统中的氯仿）在薄层板的两边易挥发，因此，它们在薄层两边的浓度比在中部的浓度小，也就是说在薄层的两边比中部含有更多的极性较大或沸点较高的溶剂，于是位于薄层两边的Rf 值要比中间的高，即所谓“边缘效应”。
为减轻或消除边缘效应，可先将展开剂导入层析缸中，使层析缸内溶剂蒸汽的饱和程度增加。