• 显示的是一个234bp 长的DNA 片段的解链区域，横坐标是该DNA 片段的序列，依次从第一个碱基到第234 个碱基；纵坐标是解链 温度。该DNA 片段共有3 个解链区域。 • MD1 是解链温度最低的一个解链区域，MD3 是温度最高的一个 解链区域。
• 不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区 域及各解链区域的解链温度也是不一样的。
微生物分子生态学的一些研究方法
微生物群落结构和多样性是微生物生态学 研究的热点内容。
群落结构决定了生态功能的特性和强弱。 群落结构的高稳定性是实现生态功能的重要因素。 群落结构变化是标记环境变化的重要方面。
通过对环境微生物群落结构和多样性进行解析并研究 其动态变化，可以为调节群落功能和发现新的重要微 生物功能类群提供可靠的依据。
2、群落水平生理学指纹方法(CLPP)
微生物所含的酶与其丰度或活性是密切相关的。 如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基质， 则这种酶-底物可作为此群落的生物标记分子之一。 由Garlan和Mills于1991年提出的群落水平生理学指纹方法 (CLPP)，通过检测微生物样品对底物利用模式来反映种群组成的 酶活性的分析方法。 具体而言，CLPP就是通过检测微生物样品对多种不同的单一碳 源的利用能力，来确定哪些基质可以作为能源，从而产生对基质 利用的生理代谢指纹。
Diversity estimation based on molecular markers
实验原理
• 16S rDNA是基因组的“biomarker‖ • – 核糖体RNA是蛋白质合成必需的，16S rDNA 广泛存在于所有原核生物的基因组中。 • – 16S rDNA的序列中包括保守区和可变区。 • – 序列变化比较缓慢，与物种的形成速度相适应， 而且一般不发生水平转移。 • – GeneBank和RDPⅡ（Ribosomal DatabaseProject ） 数据库中已经登录了超过97,128个经过比对和注释 的16S rDNA序列，可供进行比对。
4. ERIC (肠杆菌基因间保守重复序列) -PCR 指纹图谱技术
• Di Giovanni 等用ERIC-PCR分析6种纯菌组成的混合 菌的组成，获得了高重复性的指纹图谱，比常规 RAPD-PCR相比更能反映菌群的组成特征。
• 在微生物群落中，各细菌数量占1-10%时，其特征性 ERIC-PCR主条带就可以在指纹图中表现出来。ERICPCR指纹图中，每一条带可以是来自若干种不同微生 物的基因组DNA片段，条带的数目反映微生物类群的 多少，条带的亮度反映该类群微生物种群数量的高低。
BIOLOG鉴定系统
在96孔细菌培养板上检测微生物对不同发酵性碳源（95种） 利用情况。 干膜上都含有培养基和氧化还原染料四唑 微生物利用碳源进行呼吸时（产生的NADH），会将四唑从无 色还原成紫色。 每个孔中含有 不同的底物 菌悬液或 无菌水
自动化、快速
可鉴定细菌有1140多 种、酵母菌267种、目前 已经可用于丝状真菌。
பைடு நூலகம்
• 分析不同环境样品中微生物混合DNA的ERIC-PCR指 纹图谱的差异，就可比较不同生态系统微生物群落的 差异，或者同一个群落在不同功能状态下的结构变化。
ERIC-PCR引物20 pmol/μl
E1: 5'-ATgTAAgCTCCTggggATTCAC-3' E2: 5'-AAgTAAgTgACTggggTgAgCg-3'
• ―TA的过程： • 1.Amp抗性，挑选出含有质粒 的克隆 • 2.蓝白斑筛选，挑出带有插入 片段的克隆 • 3.PCR筛选，挑出带有正确长 度插入片段的克隆
ARDRA分型与测序
各OTU含有的克隆数量克隆的统计分析5. 以PCR为基础的rRNA及rDNA的分析方法
• 用于微生物群落结构分析的基因组DNA的序列包 括：核糖体操纵子基因序列(rDNA)、已知功能基 因的序列、重复序列和随机基因组序列等。
• 最常用的标记序列是核糖体操纵子基因(rDNA)。 rRNA(rDNA)在细胞中相对稳定，同时含有保守序 列及高可变序列，是微生物系统分类的一个重要 指标。
醌指纹法(Quinones Profiling) 呼吸醌广泛存在于微生物细胞膜中，在电子传递链 中起重要作用，主要有泛醌(ubiquinone辅酶Q) 和甲基 萘醌(menaquinone维生素K)。醌可以依据侧链含异戊 二烯单元的数目和侧链上使双键饱和的氢原子数进一 步区分。
每一种微生物都含有一种占优势的醌，而且不同的 微生物含有不同种类和分子结构的醌。因此，醌的多 样性可定量表征微生物的多样性，醌谱图（即醌指纹） 的变化可表征群落结构的变化。
• 当它们进行DGGE时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链 DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA 片段的迁移行为和 在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。
• 一旦DNA 片段迁移到一定位置，其变性剂浓度使双链DNA 片 段最低的解链区域解链，部分解链的DNA 片段在胶中的迁移 速率会急剧降低。因此，不同的DNA 片段会在胶中的不同位 置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分 开来。
仅能鉴定快速生长的微生物，误差较大（pH），拥有的标准数据 库还不完善
3、生物标记物法（Biomakers ）
• 生物标记物通常是微生物细胞的生化组成成分，其 总量通常与相应生物量呈正相关。 • 特定的标记物标志着特定的微生物，一些生物标记 物的组成模式(种类、数量和相对比例)可作为指纹 估价微生物群落结构。 • 首先使用一种合适的提取剂直接把生物标记物从环 境中提取出来，然后对提取物进行纯化，后用合适 的仪器加以定量测定。 优点：不需要把微生物的细胞从环境样中分离， 能克服由于培养而导致的微生物种群变化，具有 一定的客观性。
• 这一方法目前已经广泛运用于土壤、海洋、湖泊、肠 道等多种生态系统中微生物多样性的调查，揭示了环 境当中前所未知的微生物的行16S rDNA PCR扩增：把环境中几 乎所有微生物基因组上的16S rDNA扩增并收集到一起。 • universal primers: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (Esherichia coli bases 8 to 27) 和 5’-TACCTTGTTACGACTT3’ (E.coli bases 1507 to 1492)

Source: Louis, B., Gene IV年，Giovannoni等首先用这一方法分析马尾藻海 海面上浮 • 发现了一个新的且在该环境中占优势的微生物类群； • 与传统的分离培养的方法相比，更全面得揭示了微生 物多样性；
微生物群落结构和多样性研究方法：
• 20世纪70年代以前：传统的培养分离方法，依靠形态 学、培养特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定和 计数，认识是不全面和有选择性的，方法的分辨水平 低。 • 在70和80年代：对微生物化学成分的分析，建立了一 些微生物分类和定量的方法（生物标记物方法），对 环境微生物群落结构及多样性的认识进入到较客观的 层次上。 在80和90年代：现代分子生物学技术以DNA为目标物， 通过rRNA基因测序技术和基因指纹图谱等方法，比较 精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性，并给出了 关于群落结构的直观信息。
Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP)
community DNA f-primer PCR r-primer CUT A B C PAGE on SEQUENCER
Relative Intensity
C B A
16S rDNA
Fragment Size (base pairs)
A B C (ABC) internal siz e fragment
Liu et al., 1997, AEM
变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 变性梯度凝胶电泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。 • Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落 结构研究 。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝 胶电泳（Temperature gradient gel electrophoresis， TGGE）。 • 此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学 研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群 落结构的主要分子生物学方法之一 。
醌指纹法具有简单快速的特点。
磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid, PLFA）、甲基脂肪 酸酯（Fatty acid methyl ester, FAME）谱图分析
• 磷脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干重的5%。在 细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代谢 掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动 态监测。 • 脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生 物分类的依据。 • 磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸部分提取出来，然 后用气相色谱分析，得出PLFA谱图。 • 甲基脂肪酸酯是细胞膜磷脂水解产物，气相色谱分析系统分析 出全细胞的FAME谱图。 • 脂肪酸谱图法分类水平较低，不能鉴定到种。另外，不同微 生物种属之间脂肪酸组成有重叠，外来生物污染也限制了脂 肪酸谱图法对种群结构解析的可靠性。
16S ribosomal RNA
Present in all life • molecular chronometer – taxonomy (large database) – evolution one active bacterial cell: – ~ 104 copies – ~ 15 rRNA genes (i.e., rDNA) (Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, Sulfolobus solfataricus with 1 copy, Clostridium paradoxum with 15 copies) ~1500 nt (enough information) – four different domains – conserved regions (no variation among all life) – variable regions (V1-V9)