不同浓度秋水仙素和nocodazole对绒山羊成纤维细胞周期同步化的影响杨惠茹，肖红梅，蔡婷，俎红丽，于新蕾，刘志红，李金泉，王志新（内蒙古农业大学动物科学学院动物遗传育种与繁殖重点实验室，呼和浩特 010018 ）摘要：本文旨在探索更加优化的条件，使绒山羊成纤维细胞经处理后更多的处于有丝分裂G2/M 期。
本研究分别采用秋水仙素和nocodazole （诺考达唑）试剂对绒山羊成纤维细胞进行周期同步化处理，用流式细胞仪检测G2/M 期的细胞数量进行比对，观测最佳作用浓度。
结果表明，秋水仙素的使用浓度不宜过大；其次，添加秋水仙素时间的不同也会对试验结果产生明显的影响。
另外在相同条件下，经nocodazole处理的绒山羊成纤维细胞周期同步化效果比秋水仙素好，最优的处理条件是300 ng/mL nocodazole处理成纤维细胞24 h，所得G2/M期的细胞所占比例为15.10%。
结果提示对于绒山羊的成纤维细胞来说，细胞周期同步化处理时，选择nocodazole更好一些。
关键词：绒山羊；成纤维细胞；秋水仙素；nocodazole（诺考达唑）；细胞周期同步化；流式细胞仪Dolezel等（2011) 报道随着测序技术的发展，使用流式细胞仪分离单条染色体，将拓展测序技术应用的领域，对于山羊这种大基因组动物更有广泛的应用价值。
流式细胞术可以分选出指定的染色体，能快速精确地检测染色体数目和结构的畸变，以及非整倍体和染色体缺失。
目前已在l7个植物物种中利用流式细胞术对染色体进行分析与分选。
Macas等（1993）利用FCM对碗豆的流式核型进行分拣，结合PCR技术对其DNA进行物理定位，成功实现了USP基因、碗豆球蛋白基因和假基因在相应染色体区域上的定位。
施家琦等 (1998) 在人类的染色体分选研究中，通过采用流式细胞技术分离染色体实现对人二倍体成纤维细胞的单分散染色体核型的分析及分选。
最近的研究中，Yang等（2011) 通过流式技术分离出单个染色体已经完成了基因组的测序工作。
翟中和等（1992) 采用流式分离单条染色体工作的核心在于富集足量同步化的中期染色体的细胞核型，因此细胞同期化的处理是研究中最基础最为重要的一步。
细胞周期时间长短的主要差别在G1期，而S期、G2期和M 期的总时长相对恒定，尤其是M期持续的时间更为恒定，常常仅持续半小时左右。
通过添加有丝分裂抑制剂，来阻滞细胞的有丝分裂使其停滞在G2/M 期，人工调控增加G2/M期的细胞数量，为单条染色体分选做前期准备。
目前，秋水仙素是一种最为常用的有丝分裂抑制剂，起作用机理在于抑制中期纺锤体的形成。
nocodazole是一种类似于秋水仙素的细胞微管抑制剂,也可阻止微管蛋白聚合和纺锤体形成,使细胞同步于M期,从而使大部分细胞的发育停滞在G2/M期和M期，与秋水仙素试剂相比毒性较低。
Tanaka等（1995）研究表明采用nocodazole处理法对大鼠进行同期化处理后，M 期细胞的数量显著增加。
因此，本研究将采用这两种试剂对成纤维细胞同期化的最优化条件做探索。
1 材料和方法1.1材料1.1.1 试剂耗材和动物秋水仙素、nocodazole、胎牛血清（Hyclone）、，0.25%胰酶（Gibco）、DMEM/F12培养基（Hyclone）、无水乙醇（国产）、DPBS（Hyclone）、青链霉素（Gibco）、PI(碘化丙啶)、15 mL离心管（corning）、50 mL离心管（corning）、细胞培养瓶（corning）25 cm2、塑料吸管。
本研究选用绒山羊公羊耳源组织，来自于内蒙古鄂尔多斯农场。
1.1.2 主要仪器设备流式细胞仪( Beeton Diekinson FACSCalibur )、CO2恒温培养箱 ( Galaxy A，RXBiotech) 、超净工作台 ( ZHICHENG，XHJH-1112B)、倒置相差显微镜( NIKON BIOPHOT) 、离心机( Eppendorf Centrifuge 5415R) , 超纯水仪(Milli一Q)1.2 方法1.2.1 绒山羊成纤维细胞的培养选取一只健康的成年绒山羊公羊，用剪毛剪将公羊耳尖部的毛除净快速剪下耳尖约 1 cm2组织块，经过一系列处理后，将组织块均匀分布于25 cm2的培养瓶中，置于37 ℃ ,5%CO2的培养箱中贴壁培养，待细胞慢慢从组织中爬出且基本长满80%培养瓶后，进行传代培养。
1.2.2 同步化处理正常细胞作为对照组，用含0.07 ug/mL的秋水仙素对指数生长期的成纤维细胞作用4 h,12 h,16 h,18 h,24 h，用含0.15 ug/mL的秋水仙素作用18 h后收集细胞，分别观察其结果，用含100 ng/mL、300 ng/mL、1 ug/mL的nocodazole分别处理成纤维细胞18 h后，观察其结果，用含100 ng/mL、300 ng/mL、1 ug/mL的nocodazole分别处理成纤维细胞24 h后，观察其结果，最后上流式细胞仪检测。
1.2.3 流式细胞仪分析用含0.02% EDTA，0.25%的胰酶消化经同步化处理后的细胞，收集于15 mL离心管中，用PBS 洗涤2遍（1000rpm，5min）弃掉上清，先加入少量PBS混匀细胞，再加入95%乙醇或无水乙醇（-20 ℃预冷）到待测细胞悬液中，使其终浓度为70%乙醇，边加边在振荡器上震荡混匀（一滴一滴缓慢加入），混匀后直接放4 ℃冰箱过夜（细胞固定后最多可放15天），检测时再用PBS洗涤后，加PI染色，用流式细胞仪( Beeton Diekinson FACSCalibur )检测G0、G1、S、G2、M各期的细胞。
2. 结果2.1正常细胞G2/M期比例正常细胞对照组，第五代成纤维细胞经过72小时的培养，基本已经长满了整个培养瓶，汇合程度达90%以上，生长旺盛，形态正常结构完整呈长梭形（图 1 ）。
收集该细胞使用流式细胞仪( Beeton Diekinson FACSCalibur )检测，结果表明G2/M期所占比例为0.18%，细胞基本处于非生长期（图2 ）。
图 1 第五代成纤维细胞1 00倍镜下观察结果图 2 正常细胞G2/M期所占比例（备注：Dip G1为细胞G1期所占比例，Dip G2为细胞G2期所占比例，Dip S为细胞S期所占比例）2.2秋水仙碱不同作用时间下G2/M期所占比例采用0.07 ug/mL秋水仙素对指数生长期时成纤维细胞作用4、12、16、18和24 h后收集细胞，使用流式细胞仪检测，结果表明G2/M期所占比例分别为0.64%、4.63%、7.07%、10.88%和0.05%。
而0.07 ug/mL秋水仙素处理18 h，收集检测G2/M期所占比例最高为10.88%。
（图 3 ）图 3 秋水仙碱处理下G2/M期所占比例（备注：Dip G1为细胞G1期所占比例，Dip G2为细胞G2期所占比例，Dip S为细胞S期所占比例）2.3不同浓度nocodazole和不同处理时间下G2/M期所占比例采用100 ng/mL、300 ng/mL、1 ug/mL的nocodazole分别作用于指数生长期的成纤维细胞，18 h后收集，流式细胞仪( Beeton Diekinson FACSCalibur )检测，结果表明G2/M期所占比例分别为7.43%、14.34%、11.82%，而100 ng/mL、300 ng/mL、1 ug/mL的nocodazole分别处理成纤维细胞24 h后，G2/M期所占比例分别为9.23%、15.10%、12.10%。
而300 ng/mL nocodazole处理成纤维细胞18 h，收集检测G2/M期所占比例最高为14.34%。
（图 4 ），300 ng/mL nocodazole处理成纤维细胞24 h，收集检测G2/M期所占比例最高为15.10%。
（图 5 ）图 4 300 ng/mL nocodazole处理成纤维细胞18 h G2/M期所占比例（备注：Dip G1为细胞G1期所占比例，Dip G2为细胞G2期所占比例，Dip S为细胞S期所占比例）图 5 300 ng/mL nocodazole处理成纤维细胞24 h G2/M期所占比例（备注：Dip G1为细胞G1期所占比例，Dip G2为细胞G2期所占比例，Dip S为细胞S期所占比例）3. 讨论3.1正常培养的成纤维细胞未经任何处理72 h后检测G2/M期所占比例正常的成纤维细胞，未经过任何处理经过72小时的培养后镜下观察，细胞生长旺盛，已经长满整个培养瓶，结构完整且形态正常，说明细胞在72 h内已经进行多次有丝分裂。
且收集检测处于G2/M期的细胞所占比例仅为0.18%。
说明细胞已经过了指数生长期而处于平台期，基本不再分裂，增殖。
刘春霞等（2007) 通过基本方法培养细胞，可以使单层的细胞处于对数增殖期，轻微震荡，M 期细胞则易脱离器壁，悬浮于培养液中再继续培养、收集，则可获得一定数量的G2/M期细胞，赵雪萍等（2007) 通过这样的方法收集的细胞不受药物伤害且同步化程度高，缺点是获得的细胞数量较少。
3.2成纤维细胞经过不同浓度的秋水仙素的处理后检测G2/M期所占比例由于绒山羊的成纤维细胞生长时间较长，所以0.07ug/mL秋水仙素对指数生长期的成纤维细胞作用18h时，G2/M期所占比例为10.88%是最高的，而在相同的作用时间内，秋水仙素的浓度增高到0.15ug/mL，G2/M期所占比例为0.02%，秋水仙素的浓度增大，其毒性相对较大，细胞无法承受对其的作用而衰竭、死亡。
所以添加秋水仙素可以抑制（微管聚合）有丝分裂的形成，将细胞阻断在有丝分裂中期，但是，细胞没有分裂，添加秋水仙素是起不到分裂抑制作用的。
适当浓度的秋水仙素处理,可使培养细胞停顿于分裂中期；如处理过度会使染色体凝缩，秋水仙素的浓度过大也会阻碍其分裂增殖，甚至使得不能恢复正常的细胞周期进而衰竭死亡；低浓度的秋水仙素对细胞的毒性相对减少，作用时间延长，可以使秋水仙素在细胞分裂时对其产生抑制作用，使细胞停留在G2/M期。
3.3成纤维细胞经过不同浓度的nocodazole处理后检测G2/M期所占比例经过秋水仙素处理的细胞G2/M期的比例虽然明显增高，但是所得比例最高仅为10%，仍然没有达到制作染色体悬液所需要的比例，因此选用另外一种抑制动物细胞有丝分裂的抑制剂nocodazole来试图提高G2/M期所占比例。
Qian等（2010)报道nocodazole常被用于细胞增殖、分裂指数、抗肿瘤机制等方面的研究，其可以和微管中的β-tubulin结合，抑制有丝分裂时纺锤体的功能，并破坏高尔基体的结构，诱导细胞阻滞在G2/M期。