摘要 了解牛睾丸支持细胞体外培养的生物学特性， 试验采用组合酶消化和选择贴壁法， 将 ５月 龄、 ６月龄牛胎儿及新生牛睾丸支持细胞分离纯化后进行体外培养。试验结果显示， 这一阶段牛 睾丸适宜支持细胞分离纯化用； 采用 ０ ． ２ ５％胰蛋白酶 ＋ ０ ． ０ ２％Ｅ Ｄ Ｔ Ａ二次消化法是一种经济有 效的牛胎儿睾丸支持细胞分离方案； 试验发现， 牛胎儿睾丸支持细胞体外研究时间应控制在 ３～ ２ ０天内， 处于对数生长期的牛胎儿睾丸支持细胞， 对牛体外受精卵体外发育有明显的促进作用。 关键词 牛 睾丸支持细胞 体外培养 生长行为 中图分类号 Ｑ ９ ５ ４ ． ４
激素结合蛋白（ ａ ｎ ｄ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎｂ ｉ ｎ ｄ ｉ ｎ ｇｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ， Ａ Ｂ Ｐ ） 、 苗勒氏 管抑制物质（ ｍ ｕ ｌ ｌ ｅ ｒ ｉ ａ ｎｉ ｎ ｈ ｉ ｂ ｉ ｔ ｉ ｎ ｇｓ ｕ ｂ ｓ ｔ ａ ｎ ｃ ｅ ， Ｍ Ｉ Ｓ ） 、 抑制 素（ ｉ ｎ ｈ ｉ ｂ ｉ ｎ ） 、激 活 素 （ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｎ ） 、转 化 生 长 因 子 β （ Ｔ Ｇ Ｆ ） 、 胰岛素样生长因子 １ （ Ｉ Ｇ Ｆ １ ） 、 白介素 １和 ６ β
） 表１ 酶消化法分离牛胎儿睾丸支持细胞的结果 ａ
件， 牛睾丸支持细胞贴壁效果优于 ３ ７ ℃， 但差异不显著 Ｐ＞ ０ ． ０ ５ ） 。试验结果见表 ３ 。 （
表３ 温度对原代支持细胞贴壁效果的研究
５ （ 细胞数： × １ ０ ）（ Ｍｅ ａ ｎ± Ｓ Ｄ ）
Ｔ ａ ｂ ｌ ｅ ３ Ｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎｏ ｆ ｔ ｅ ｍｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｕ ｒ ｅｔ ｏａ ｔ ｔ ａ ｃ ｈ ｉ ｎ ｇ
５ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｏ ｆ ｐ ｒ ｉ ｍａ ｒ ｙＳ Ｃ ｓ （ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ：× １ ０ ）
对比因素 ３ ７ ℃ ３ ８ ． ５ ℃
接种密度 １ ０ １ ０
贴壁细胞数 ３ ． ８ ３± ０ ． ８ ５ ５ ． １ ５± ０ ． ６ ６
贴壁率％
ａ ３ ８ ． ２ ９± ８ ． ５ ４ ａ ５ １ ． ５ ３± ６ ． ５ ７
９ ８
中国生物工程杂志 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａＢ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ
Ｖ ｏ ｌ ． ２ ７Ｎ ｏ ． ５２ ０ ０ ７
２ ． ２ 酶消化法对支持细胞分离效果比较 试 验 中 对 比 了 Ｉ Ｖ胶 原 酶 （ Ａ 组） 与胰蛋白酶 ＋ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ （ Ｂ组） 对牛胎儿睾丸支持细胞的分离效果。结 果显示， Ａ组细胞总数与细胞存活率均极显著高于 Ｂ 组（ Ｐ＜ ０ ． ０ １ ） ， 分离效果较好， 见表 １ ； 但其细胞贴壁率 Ｐ＞ ０ ． ０ ５ ） ， 见表 ２ 。 略低于 Ｂ组（
Ａ ： ５月龄牛胎儿睾丸织织 Ｈ Ｅ染色（ ６ ０ ０× ） ； Ｂ ： ６月龄牛胎儿睾丸组织 Ｈ Ｅ染色（ ６ ０ ０× ） ； Ｃ ： 新生牛睾丸组织 Ｈ Ｅ染色（ ４ ０ ０× ）
Ｆ ｉ ｇ ． １ Ｂ ｏ ｖ ｉ ｎ ｅｔ ｅ ｓ ｔ ｉ ｓ ｔ ｉ ｓ ｓ ｕ ｅｓ ｔ ａ ｉ ｎ ｅ ｄｂ ｙＨ Ｅ
（ 细胞数： × １ ０）（ Ｍｅ ａ ｎ± Ｓ Ｄ ） Ｔ ａ ｂ ｌ ｅ １ Ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｏ ｆ ｂ ｏ ｖ ｉ ｎ ｅｆ ｅ ｔ ａ ｌ Ｓ Ｃ ｓ ｂ ｙ
６
中， 分别置于 ３ ７ ℃ 和３ ８ ． ５ ℃、 ５ ％Ｃ Ｏ 、 饱和湿度条件下 ２ 培养， 定时观察细胞贴壁情况， 当见到细胞开始贴壁时 （ 体外培养约 ５ ｈ 后） 小心倾斜培养皿， 将尚未贴壁的生 殖细胞随培养液一起吸去， 用Ｐ Ｂ Ｓ Ａ冲洗后， 重新加入 培养液继续培养， 即可获得贴壁牛胎儿睾丸支持细胞。 试验自接种起， 每隔 ２ ４ ｈ各取 ３个孔， 用血球计数板分 别计数贴壁支持细胞数目， 取平均值， 连续进行 ７天。 １ ． ２ ． ６ 支持细胞单层的制备 选择接种 ７ ２ ｈ后牛胎 Ｂ Ｓ Ａ 冲洗 ３ 儿睾丸支持细胞单层， 吸除培养液并用 Ｐ 次， 加入 １ｍ ｌ ０ ． ２ ５ ％ 胰蛋白酶 ＋ ０ ． ０ ２ ％Ｅ Ｄ Ｔ Ａ消化至 ６ ０ ％细胞脱落， 加入等量 Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ＋ １ ０ ％心 ５ ｍ ｉ ｎ ， 弃上清。加入牛胚胎培养液调整
睾丸支持细胞（ ｓ ｅ ｒ ｔ ｏ ｌ ｉ ｃ ｅ ｌ ｌ ， Ｓ Ｃ ） 及结构是 Ｅ ｎ ｒ ｉ ｃ ａ ｌ 在 １ ８ ６ ５年首次描述的， 因其在结构上为生精细胞分化提 供支持， 为生精过程提供能量及营养， 因此称为生精细 胞的“ 保姆细胞” 。在复杂动态生精过程中， 支持细胞 扮演重要角色， 不但在向生精上皮传递促性腺激素过 程中发挥中枢作用， 控制生精细胞的有丝分裂、 减数分 裂及后续分化一系列动态过程， 而且具有支持、 营养、 吞噬、 释放、 分泌等多种功能； 同时， 支持细胞之间形成 的紧密连结构成血睾屏障， 除阻止外来抗原进入睾丸， 引发免疫应答外， 还可防止自身抗原（ 生精细胞） 与机
收稿日期： ２ ０ ０ ７ ０ １ ２ ３ 修回日期： ２ ０ ０ ７ ０ ３ ０ ８ ２ ０ ０ １ ３ １ １ ０ ２ ） 新疆维吾尔自治区科技攻关项目（ 电子信箱：ｃ ｈ ｅ ｎ ｊ ｉ ｎ ｇ ｂ ｏ １ ２ ６ ＠１ ２ ６ ． ｃ ｏ ｍ 通讯作者， — —兰州军区乌鲁木齐总医院实验科 现工作单位—
保证了精子发生正常有序地进行。近年来， 随着对支 持细胞研究的深入， 其强大的内分泌调节功能引起越 来越多的关注。研究表明支持细胞天然、 稳定和高表
２ ］ 达Ｆ ａ ｓ Ｌ ， 是产生免疫耐受的功能细胞 ［ ， 并能分泌雄
１ 材料与方法
１ ． １ 材 料 １ ． １ ． １ 材料来源 ４个 ５月龄牛胎儿睾丸、 ２个 ６月龄 牛胎儿睾丸， 采自乌鲁木齐天鹰屠宰场， 月龄判断标准 １个新生牛睾丸， 由新 参照秦鹏春《 哺乳动物胚胎学》 ； 疆乌鲁木齐种牛场一分厂提供。 １ ． １ ． ２ 试剂及器械 Ｌ 谷氨酸盐（ Ｓ ｉ ｇ ｍ ａ ） 、 谷胱甘肽 （ Ｓ ｉ ｇ ｍ ａ ） 、 卡那霉素（ Ｓ ｉ ｇ ｍ ａ ） 、 胶原酶 Ｉ Ｖ （ Ｃ Ｌ Ｓ ，Ｓ ｉ ｇ ｍ ａ ） ， 胰蛋白酶（ Ｓ ｉ ｇ ｍ ａ ） ， 新生牛血清（ Ｎ Ｂ Ｓ ，Ｇ ｉ ｂ ｃ ｏ ） ， Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ 培养基（ Ｇ ｉ ｂ ｃ ｏ ） ， 瑞氏 姬姆萨染色液（ 珠海贝索生物） ， 其他化学试剂均为国产分析纯， 实验用金属及玻璃器 皿用前均清洗干净并高压灭菌处理。
２ ０ ０ ７ ， ２ ７ （ ５ ）
１ ． ２ 方 法
赵云程 等： 牛睾丸支持细胞分离、 纯化及体外生长行为的研究
９ ７
× １ ０ ０ ％ 加入新培养 １ ． ２ ． ５ 生长曲线测定 取适量细胞悬液，
５ 液调整细胞密度为 ８× １ ０ 个／ ｍ ｌ ， 接种于两块 ２ ４孔板
１ ． ２ ． １ 取材与曲细精管离散 取牛睾丸， 一侧除去鞘 膜及白膜， 切取成约 ０ ． ５～ １ ． ０ｃ ｍ 的小块， 立即置入多 聚甲醛固定液中， 按常规步骤制作石蜡切片， Ｈ Ｅ染色。 另一侧或两侧连同阴囊置冰块中保存， ２ ｈ内带回实验 ５ ％ 的乙醇中浸泡 室， 剥离阴囊及鞘膜后， 将睾丸置于 ７ ２ ｍ ｉ ｎ ， 然后用加有双抗的无钙镁磷酸缓冲液（ Ｐ Ｂ Ｓ ） 冲洗 ３遍， 在睾丸白膜上做 Ｔ字形切口， 取出睾丸实质组织， 用添加双抗的 Ｐ Ｂ Ｓ 漂洗 ３次， 洗去血污后置平皿中。 １ ． ２ ． ２ 支持细胞的酶解分离 组织块离散后剪碎， 采 用两步酶消化法分离睾丸细胞。第一步消化时， Ａ组 ｍ ｇ ／ ｍ ｌ 胶原酶 Ｉ Ｖ ， Ｂ组（ 右侧睾丸） 以 （ 左侧睾丸） 以１ ０ ． ２ ５ ％胰蛋白酶和 ０ ． ０ ２ ％Ｅ Ｄ Ｔ Ａ室温下振荡消化 １ ５ ｍ ｉ ｎ ， 加入 Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ＋ １ ０ ％Ｎ Ｃ Ｓ终止消化， ５ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ离 ｍ ｉ ｎ 弃上清。第二步消化均以 ０ ． ２ ５ ％ 胰蛋白酶和 心５ ０ ． ０ ２ ％Ｅ Ｄ Ｔ Ａ室 温 下 消 化 １ ５ｍ ｉ ｎ ， 加入 Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ＋ １ ０ ％ Ｎ Ｃ Ｓ 终止消化， １ ０ ０目滤网过滤， １ ５ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ离心 ５ ｍ ｉ ｎ ， 弃上清。Ａ 、 Ｂ两组各取等体积睾丸细胞悬液， 进行存 活率测定， 团块、 碎片数测定， 及贴壁率测定。 １ ． ２ ． ３ 细胞计数 取细胞悬液与 ０ ． ５ ％ 台盼蓝 １ ∶ １ 混 匀后， 在倒置显微镜下， 用血球计数板计数圆形透明的 活细胞数及染成蓝色的死细胞数， 计算总数、 存活率、 细胞碎片及团块数。 １ ． ２ ． ４ 细胞贴壁率 取适量细胞悬液， 加入新鲜培养 １ ０ 个／ ｍ ｌ 接种， 定时观察细胞 液调整细胞密度为 １× ｈ 贴壁情况， 当见到细胞开始贴壁时 （ 体外培养约 ５ 后） 小心倾斜培养皿， 将尚未贴壁的生殖细胞随培养液 一起吸去， 用Ｐ Ｂ Ｓ Ａ冲洗， 加０ ． ２ ５ ％ 胰蛋白酶和 ０ ． ０ ２ ％ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ消化已贴壁细胞 ５ ｍ ｉ ｎ ， 加入等体积 Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ＋ １ ０ ％ Ｎ Ｃ Ｓ 终止消化， 取细胞悬液计数后， 代入以下公式计算 贴壁率： 细胞贴壁率（ ％）＝ （ 贴壁细胞数 ／ 接种细胞总数）
４ 细胞密度为 １～ ２ ． ０× １ ０ 个／ ｍ ｌ ， 接种于 ２ ４孔培养板，
５ ｈ 后即可获得传代牛胎儿睾丸支持细胞单层。 １ ． ２ ． ７ 牛胎儿睾丸支持细胞与胚胎共培养 制备的牛 胎儿睾丸支持细胞单层， 使用前用胚胎培养液吹洗 ３次， 以去除混杂于支持细胞间尚未贴壁的生殖细胞。加入 ５ ０ ０ ｌ 胚胎培养液， 移入受精卵， 进行共培养， 每隔 ４ ８ｈ μ 换液。观察受精卵发育情况及支持细胞生长情况。 １ ． ２ ． ８ 数据处理与统计分析 试验数据用 Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ１ ３ ． ０ 处理， 统计分析结果。
中国生物工程杂志 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａＢ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， ２ ０ ０ ７ ， ２ ７ （ ５ ） ： ９ ６～ １ ０ ０