实验26 过氧化氢酶活力的测定（必修）
[目的与原理]
掌握过氧化氢酶活力的测定原理和比色测定方法，并用此方法测定水产动物血清中过氧化氢酶的活力。
血清中的过氧化氢酶（CA T）分解H2O2的反应，可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其生成量，即可计算出CA T 的活力，CAT活力单位定义为：每1分钟分解1μmol的过氧化氢即为1个酶活力单位（U）。
[试剂与器材]
试剂：
1、磷酸盐缓冲液（67mmol / l，pH=7.4）：取Na2HP04 7.60g，KH2P041.82g，溶于1L蒸馏水中，调pH至7.4。
2、基质液（65μmol/ l, H2O2）：取30% H2O2 3.69 ml加pH7.4磷酸盐缓冲液至500ml。
3、钼酸铵：称取［(NH4)6Mo7O24］20.2g溶于500ml蒸馏水中。
器材：
721分光光度计, 0.5cm比色杯，恒温水箱（37℃±0.5℃），试管16mm×100mm，移液管，吸耳球，可调微量进样器。
[实验步骤]
1、样品测定：基质液置于37℃水浴5 min，然后按下列步骤操作
试剂对照管标准管测定管
基质液 1.0ml 1.0ml 1.0ml
钼酸铵 1.0ml 1.0ml —
缓冲液—0.2ml —
血清0.2ml —0.2ml
37℃水浴准确温育60s后，立即加入钼酸铵1.0ml摇匀，10min后于405nm以蒸馏水调零比色。
记录各管吸光度值（A）
2、计算：
过氧化氢酶活力(U/ L)= [(A对－A测)/ A标] ×（65×1×1000/0.2 ×1000）
= [(A对－A测)/ A标]×325
(式中65为标准管H2O2浓度，1为1.0ml H2O2体积，1000换算成1L血清，0.2为血清用量，1000为μmol换算成mmol)
[方法评估]
本实验采用分光光度法测定底物（H2O2）的减少量来评价过氧化氢酶活力。
此法操作简便、准确，在实验时间（1小时）内显色稳定，适于科研和实验检验用。
[应用意义]
CA T具有重要的生理功能，细胞内与产生H2O2的需氧脱氢酶类（如氨基酸氧化酶等）同时存在，能将细胞代谢所产生的毒性物质H2O2迅速加以清除，从而共同保护血红蛋白、巯基酶、膜蛋白和解毒作用。
此外，CA T清除H2O2后可减少过氧化脂质生成和对人体的毒害，因而有抗衰老和保护作用。
[注意事项]
1、反应时间在80秒内吸光度降低与反应时间成反比关系，故选用60秒为测定时间（所以本法不宜大批量样品同时测定，以每批4～5份为宜）。
2、酶活力在100~140U范围内呈线性关系；钼酸铵和H2O2呈色反应在pH＜7时吸光度升高，当pH＞7.6时吸光度下降，故选用pH7.4作为测定条件。
3、黄色复合物至少在1h内稳定。
4、血清不能溶血，溶血样品应该弃去。
5、加入钼酸铵后，由于释放O2，气泡会干扰比色，宜在显色10min后比色。
[思考题]
1、试述过氧化氢酶的测定方法？
2、底物与血液中过氧化氢酶反应时间为什么要准确定为60秒？
3、试述过氧化氢酶催化H2O2反应的机制？
淀粉酶活力的测定（必修）
[目的与原理]
掌握淀粉酶活力的测定方法，测定水产经济动物的主要消化器官肝胰脏、胃、肠内的淀粉酶活力。
淀粉酶催化淀粉分子中葡萄糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖等。
在基质充分的条件下，反应后加入的碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色深浅与未经酶促反应的空白管比较其吸光度，从而推算出淀粉酶的活力单位。
[试剂与器材]
试剂：
1、0.04%可溶性淀粉
精确称取可溶性淀粉0.20g，置于20ml烧杯内，加入蒸馏水约5ml，摇匀使成淀粉混悬液，另称取无水磷酸二氢钠13.3g及苯甲酸4.3g，共置于500ml烧杯内，加入蒸馏水约250ml,煮沸后，将淀粉混悬液倒入此烧杯内，并用蒸馏水洗涤装淀粉混悬液的烧杯数次，洗涤亦倒入此烧杯内。
继续煮沸1分钟，冷却至室温后倒入500ml容量瓶中，并用蒸馏水稀释至500ml 刻度。
此淀粉液pH应为7.0±0.1，在室温下保存2―3个月。
2、0.1N碘贮存液：精确称取碘酸钾(KIO3) 3.567g及碘化钾（KI）45g置于1L容量瓶内，加入蒸馏水约800ml，然后缓慢加入浓盐酸9ml，摇匀后用蒸馏水稀释至1L刻度，置冰箱内备用。
3、0.01N碘应用液：取0.1N碘贮存液50ml，用蒸馏水稀释至500ml，盛于棕色瓶中置冰箱内约保存1个月。
材料：
新鲜鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。
器材：
分光光度计、电子天平、离心机、pH测定仪，恒温水箱、匀浆器、剪子、镊子、冰块、50ml比色管若干、移液管若干，500ml容量瓶，烧杯。
[实验步骤]
1、酶提取液的制备
取新鲜肝胰脏、胃、肠组织称重，在冰盘上剔除脂肪及内容物，以10倍缓冲液或去离子水匀浆各组织，将组织悬液低温下离心（3000rpm/min）,上清液为酶粗提液（酶液）。
2、（见实验蛋白酶活力的测定）
2、淀粉酶活力的测定
取50ml刻度比色管二只，标明为对照管，测定管。
对照管测定管
0.04％可溶性淀粉 5.0ml 5.0ml
将两管在37℃水浴中预热2—5分钟
酶液—0.1ml
测定管混匀后，再置37℃水浴中反应7.5分钟
0.01N碘应用液 5.0ml 5.0ml
用蒸馏水稀释至50ml，立即混匀。
用660nm或红色滤光板进行比色，以蒸馏水校正光密度0点，读取对照管和测定管光密度读数。
3、计算
淀粉酶活力单位定义：在370C、30min内，100ml酶液中的淀粉酶能完全水解淀粉10mg 称为一个淀粉酶活力单位。
淀粉酶活力单位/100ml＝（对照管光密度—测定管光密度）/对照管光密度×2/10×30/7.5×100/0.1=（对照管光密度—测定管光密度）/对照管光密度×800
[方法评估]
测定淀粉酶的方法有很多种，大致可分为两类：即测定底物（淀粉）的减少量和测定产物（如还原性糖）的生成量。
本实验采用前者的淀粉—碘比色法。
[应用意义]
分析淀粉酶的活力有助于了解水产动物对食物中淀粉的消化能力，由于鱼虾等水产动物种类与大小的差异和所提供食物品质的不同，以及动物所处生活环境的变化，各种水产动物对食物的消化吸收有明显的差别。
认识鱼虾消化酶变化特性，为研究水产种类饲料配伍提供科学依据
[注意事项]
1、0.04%可溶性淀粉溶液5ml内含淀粉量为2mg，在本法条件下，当2mg淀粉完全水解时相当于800淀粉酶单位／100ml（即：2/10 × 30/7.5 × 100/0.1 = 800）。
2、对照管内含淀粉2mg，由于淀粉溶液比较稳定，故对照管在固定比色计上的光密度读数并不改变，因而在测定中不必每次作对照管。
3、当淀粉酶接近800单位时，由于淀粉已几乎完全被水解，故加入碘液后也不再显蓝色，因此淀粉酶单位较高时（接近600单位）宜将标本稀释（2～5倍）后重新测定，并将测定结果乘以稀释倍数。
4、如淀粉溶液出现混浊或絮状物，表示淀粉溶液污染或变质，不能再用。
5、唾液内含有大量的淀粉酶，故即使是唾液的飞沫污染，也能使测定结果显著偏高。
[思考题]
1、试述淀粉—碘比色法测定淀粉酶活力的原理？
2、影响淀粉酶活力大小的因素有哪些？。