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四、实验步骤
• 装槽、上样：
30μL左右
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四、实验步骤
• 电泳：
接好电源线（上槽接负极，下槽接正极）。 打开电源开关，调节电压，以10V/cm稳定电压 电泳，待前沿指示染料溴酚蓝下行至距胶板末 端1-2 cm处，即可停止电泳。
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四、实验步骤
• 剥胶、染色：
电泳结束之后，将垂直板从电泳槽上取下， 小心地将两块玻璃板分开，并小心地将凝胶置 于染色盒中，进行染色反应，染色时间为 10min左右，用水漂洗1-2次即可。
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四、实验步骤
• 凝胶制备：
聚丙烯酰胺凝胶配方
成分
含量
N液（29.2%Acr-0.8%Bis） 5mL
L液（Tris）
5mL
蒸馏水
10mL
TEMED
20μL
10% AP
100μL
作用
交联剂 缓冲液
加速剂
催化剂
4℃储存，用量可 适量调整
现用现配，用量 可适量调整
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四、实验步骤
• 样品制备：
称 取 0.5g 植 物 幼 苗 ， 放 入 研 钵 内 ， 加 入 1mL样品提取液（pH8.0），于冰浴中研成匀 浆，全部转入1.5mL离心管中，10000r/min离 心 10min ， 吸 取 100μL 上 清 液 至 新 离 心 管 中 ， 加入等量的上样缓冲液，混匀，即为样品液。
—
○+ ○-
+
○-
○+
二、实验原理
2、电泳分类：
✓ 显微电泳 ✓ 自由界面电泳 ✓ 区带电泳
– 纸电泳 – 醋酸薄膜电泳 – 琼脂糖凝胶电泳 – 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
二、实验原理
3、电泳法原理：在一定条件下，任何带点颗粒都 有自己特定的电泳迁移率。影响电泳迁移率的因 素：
✓ 颗粒性质：净电荷数目、颗粒大小、颗粒形状 ✓ 电场强度：V/cm ✓ 溶液性质：缓冲液的pH、离子强度、溶液黏度、
电渗
二、实验原理
4、聚丙烯酰胺凝胶电泳：是由单体丙烯酰胺 （Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在 加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）和催 化剂过硫酸铵（AP）的作用下聚合交联成三维网 状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚 丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)
（2）过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种 酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。 在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，测定 这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植 物体内代谢的变化。
二、实验原理
➢ 过氧化物同工酶及活性染色
（3）本实验采用PAGE技术，分离植物幼苗过氧化物酶 同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的 不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
➢ 浓缩效应：凝胶为不连续系统（凝胶层、pH、电位梯 度均不连续），从而使样品浓缩在一个极窄的起始区带 ，即所谓浓缩效应，提高了条带分辩率。（只有不连续 凝胶具有此效应）
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二、实验原理
➢ 过氧化物同工酶及活性染色
（1）同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身 的分子结构及其理化性质不同的一组酶。同功酶是机体调节 酶活性的一种方式，在各种生物体中广泛存在。
实验四 过氧化物同工酶聚丙烯酰胺凝胶 电泳（PAGE）分析
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一、实验目的
（1）掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术的 原理和操作方法。
（2）掌握PAGE法分离过氧化物同工酶的原理和 方法。
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二、实验原理
➢ 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） ➢ 过氧化物同工酶及活性染色
二、实验原理
1、电泳概念：带电粒子在电场中向与其电性相反 的电极移动的现象。
反应过程：
➢ TEMED催化AP生成硫酸自由基
S2O82－
2SO4·¯
➢ 硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体 长链：
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➢ Bis将单体长链间连成网状结构：
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PAGE法分离蛋白质的三种效应：
➢ 电荷效应：各种蛋白质分子所带电荷不同，在同一电场 中泳动率不同；
➢ 分子筛效应：蛋白质分子大小和形状各不相同，在通过 一定浓度（一定孔径）凝胶时受阻力各不相同，泳动率 也不相同；
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五、实验结果与分析
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ห้องสมุดไป่ตู้
需要说明：
1、同工酶的数量。
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2、同工酶的分子量大小。
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3、同工酶的含量大小。
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六、思考题
1、简述过氧化物同工酶丙烯酰胺电泳的原理。 2、请说明本实验过程中的注意事项。 3、简述丙烯酰胺电泳的操作要点。 4、上样缓冲液中蔗糖和溴酚蓝的作用是什么？
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双氧水
过氧化物+过氧化物酶 → 复合物
复合物+DH2 → 过氧化物酶+H2O+D
联苯胺
棕色物质
三、仪器和试剂
1、仪器： 高速离心机、垂直电泳槽、电泳仪。
2、试剂： 样品提取液、上样缓冲液（0.5%溴酚蓝+40%蔗
糖）、凝胶贮液N液、分离胶缓冲液L液、10%过硫酸 铵、TEMED、1×电极缓冲液、同工酶显色液。