常规病毒学实验技术（一）病毒的培养实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠主要用于：①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒②培养病毒，制造抗原和疫苗③测定各毒株之间的抗原关系，（用实验动物作中和试验和交叉保护实验）④制备免疫血清和单克隆抗体⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。

鸡胚（一）条件要求SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。

新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。

（二）优点组织分化程度低，可选择不同的日龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有大量病毒，容易采集和处理，而且来源充足，设备和操作简便易行。

（三）接种途径1．绒毛尿囊膜接种（10-12日龄鸡胚）主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。

1）方法一（造人工气室）①在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的烤焦圈。

②用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。

③在气室端中央钻一个小孔。

④用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。

⑤滴加滴生理盐水于刺破处，用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。

⑥用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。

⑦用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用石蜡密封。

⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。

2）方法二①在气室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的口。

②用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。

③滴入接种物。

④用透明胶纸封闭开口。

2．尿囊腔接种（10-11日龄）用于正粘病毒和副粘病毒（NDV）1）画出气室和胚位2）在气室接近胚位处涂沫碘酊和酒精消毒3）用钢锥穿一小孔4）将注射器针头沿此小孔插入0.5-1cm，注入接种物5）用石蜡封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次3．卵黄囊接种（6-8日龄）主要用虫媒病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。

1）画出气室和胚位2）垂直放置在卵座上，用碘酊和酒精消毒气室外端3）以钢锥在气室中央锥一小孔4）将注射器针头沿此小孔插入3cm，注入接种物5）用石蜡封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次4．其它接种途径羊膜腔接种，正粘病毒和副粘病毒静脉接种，蓝舌病毒脑内接种，狂犬病毒组织培养原代细胞：应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液，适当洗涤以后，加入营养液，通常即可使其贴附于玻璃壁上，并生长增殖。

继代细胞：将原代细胞从玻璃瓶壁上消化下来再作培养。

传代细胞：由于遗传突变或者在理化学物质和致瘤病毒的作用下，组织培养细胞中有时出现恶性变细胞，也就是癌变细胞，这种病变细胞具有很高的增殖势能，而且几乎可以无限地传代。

原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）1）在无菌条件下采取9-10日龄鸡胚，置灭菌平皿中，除去头（或仅除去喙和眼）、爪和内脏，并剪成块。

2）用Hanks液，充分冲洗后移入大号青霉素瓶或其它广口瓶中，用眼科剪剪成1mm3大小的碎块。

3）加入Hanks液，充分冲洗，并静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加洗液。

如此反复冲洗2-3遍。

4）于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶，并调整pH至7.6-7.8，振荡混匀后置37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次。

5）取出，小心吸弃上层胰酶溶液，用洗液轻洗2次后，用大口径吸管反复吹打，使细胞游离。

6）用双层或三层纱布过滤，收集滤液于离心管中，以600rpm离心沉淀5-10min，吸弃上清液，按每个鸡胚5ml的量，加入营养液，并用吸管反复吹打，直至形成均匀的细胞悬液。

7）细胞计数（培养时，使细胞达到5×105个/ml）取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫——构椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10分钟，充分振荡后进行计数。

按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。

每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。

传代细胞系培养优点：1)可以无限的传代。

2)不少细胞系对病毒很敏感。

3)某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。

4)生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。

缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。

细胞分散剂1．胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。

2．乙二胺四乙酸二钠（EDTA）营养液1．人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。

2．血清1）动物血清中含有细胞生长所必须的各种营养因子。

2）促进细胞的贴壁和生长。

3）具有很强的酸碱缓冲作用。

（二）病毒感染力的滴定LD50，EID50，TCID50（TCID50的测定）1．在青霉素瓶中将病毒作连续10倍的稀释，从10-1—10-10。

2．将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度作8孔，每孔接种100ul。

3．然后在每孔加入细胞悬液100ul，使细胞量达到3×105个/ml。

4．设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。

5．逐日观察并纪录结果，一般需要观察5-7天。

6．结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。

TCID50的计算方法：高于50%的百分数-50% 91.6-50距离比例= = =0.8高于50%的百分数-低于50%的百分数 91.6-40lgTCID50=距离此例X稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数=0.8×(-1)+(-3)=-3.8TCID50=10-3.82. Karber法病毒液稀释度出现CPE孔的比率10-1 8/8=110-2 8/8=110-3 7/8=0.87510-4 3/8=0.37510-5 1/8=0.12510-6 0/8=0lgTCID50=L-d(s-0.5)L: 最高稀释度的对数D：稀释度对数之间的差S：阳性孔比率总和lgTCID50=-1-（-1）×(3.375-0.5)=-3.875TCID50=10-3.875/0.1ml（三）病毒中和试验一、原理抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使后者丧失感染能力。

二、用途1. 疾病诊断。

2. 病毒分离株的鉴定。

3. 不同病毒株的抗原关系研究。

4. 疫苗免疫原性的评价。

5. 免疫血清的质量评价。

6. 测定实验动物血清中是否存在抗体等。

三、分类（一）终点法中和试验1. 固定病毒——稀释血清法。

1) 将测好TCID50的病毒稀释成200个TCID50的病毒悬液。

2) 在96孔微量培养板中将血清作连续倍比稀释（具体方法是在96孔板中先加入50ul生长液，再加50ul待检血清，混匀后，吸50ul至下一孔，如此下去。

一直到1:256），每个稀释度作4孔。

3) 在上述各孔内加入50ul稀释好的病毒液，混匀后放入37℃5%CO2培养箱中作用45min-60min。

4) 同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照。

5) 感作完成后每孔加入100ul细胞悬液，放37℃5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果。

6) 结果计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。

Reed-Muench计算方法：血清稀释度CPE孔数无CPE孔数累计CPE孔数无CPE孔数保护率（%）1:4（10-0.6）0 4 0 9 1001:16（10-1.2） 1 3 1 5 831:64（10-1.8） 2 2 3 2 401:256（10-2.4） 4 0 7 0 01:1024（10-3.0） 4 0 11 0 0高于50%的保护率-50%距离比例=高于50%的保护率—低于50%的保护率83-50= = 0.783-40高于50%的保护率血清稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数=-1.2+0.77×(-0.6)=-1.66-1.66的反对数=1/46即：1:46稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE。

2. 固定血清——稀释病毒法。

1) 将病毒作连续10倍稀释1）将稀释好的病毒接种96孔板，每个稀释度接种一纵排共8孔，每孔50μl，做两块板子，在一块板子的每孔加入50μl待检血清（试验组），另一块板子的每孔加入50μl正常血清（对照组），混合后置37℃ 5%CO2培养箱作用1h。

2）然后在每孔中加入100μl细胞。

3）另外还设两纵排正常细胞对照。

4）置37℃ 5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果。

5）分别计算每组病毒的TCID50，然后计算血清的中和指数。

试验组TCID50中和指数=对照组TCID50(二) 蚀斑（痘斑）减数试验1、蚀斑技术病毒蚀斑：又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。

原理：将病毒悬液作连续的10倍稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂糖，待其出现蚀斑后计数，即可算出每毫升病毒悬液中所含的蚀斑单位。

用途：①用于病毒纯化；②测定病毒悬液中感染病毒的含量。

2、蚀斑减数试验将病毒——正常血清混合物以及病毒——待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定，比较病毒——正常血清组和病毒——待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。

以试验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。

(三) 交叉保护试验先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检V的种类或型别。

其缺点是试验周期太长，并且需要大量的实验动物。

用途：（1）应用已知V鉴定未知V（2）应用已知免疫血清鉴定未知V（3）应用已知V鉴定未知血清（四）病毒的分离和鉴定病毒材料的注备1．脑、肝、肌肉等器官或组织充分研磨后加入5倍量的Hank’s液（内含P.S各200V/ml）反复冻融三次。

2000rpm 10min，取上清作接种物。

2．鼻液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物用内含青、链霉素100u/ml的Hank’s液，将其稀释3-5倍，充分混匀悬浮后，置4℃冰箱内感作2-4h或过夜，200rpm 10min取上清作接种物。

3．咽喉拭子或鼻拭子仔细用棉拭子擦拭咽喉部，并迅速将其泡入盛有2-5ml Hank’s液的（200-500u/ml P.S）试管内，充分涮洗棉拭子，反复冻融3-5次，收集液体部分，2000rpm 10min，收集上清作接种物。