细胞培养技术进阶教程
低温保护剂的应用
• 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透 性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对 水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程， 能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在 胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少 冰晶对细胞的损伤。
细胞培养技术进阶教程
细胞冻存方法
• 1、预先配制冻存液： 含20%血清培养基10% DMSO
– 冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％， 无微生物污染。细胞浓度控制在：1×107－ 5×107/ml。
细胞培养技术进阶教程
细胞复苏方法
• （l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～ ~38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。
• （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的5-10 倍以上。
• （3）低速离心10分钟。 • （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的
1、培养液PH值（颜色变化）
• 变黄，表示PH值下降，细胞生长旺盛，代 谢产生的酸性物不断积累导致。
• 变红或紫红色，表示PH值上升，细胞生长 停滞、死亡。
• 一般生长稳定的细胞需要2-3天换液1次，生 长慢的细胞需要3-4天换液一次。原代细胞 换液通常每周两次，每次换半量或1/5-1/3 量。原代细胞第1次换液时，切记不要把培 养液全部倒掉。
细胞培养技术进阶教程
3、微生物污染：
• 培养液颜色与透明度： • 培养液混浊，液体内漂菌丝或细胞菌。 • 支原体污染，没有明显症状，但细胞生长
却明显变缓。
细胞培养技术进阶教程
细胞培养的污染和检测
• 胞污染的种类 细菌、酵母菌、霉菌和病毒
• 污染源 无菌操作技术不当 操作室环境不佳 污染之血清 污染之细胞
细胞培养技术进阶教程
4、细胞冻存、复苏和运输
细胞培养技术进阶教程
冻存和复苏的原则：慢冻快融
• 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水， 细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
• • 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大
的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器 的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成 大冰晶，即冰晶的重结晶。
• 1、取材 • 2、漂洗 • 3、剪切 • 4、消化 • 5、过滤 • 6、清洗 • 7、计数 • 8、接种
细胞培养技术进阶教程
2、细胞生长状况的观察
培养细胞生长状况常规检查
• 1、培养液：颜色与透明度的变化 • 2、细胞生长状况。 • 3、细胞形态变化。 • 4、微生物污染。
细胞培养技术进阶教程
• 3. 吸去胰蛋白酶液，加入含血清的培养液。
细胞培养技术进阶教程
• 4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁 细胞，形成细胞悬液(按顺序)。然后离心沉 淀细胞。
• 5. 吸取1:2-5细胞悬液，接种于新的培养瓶 内。
• 6. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的 新培养瓶内。
• 7. 将后者放入培养箱中培养。
• 1. 吸光培养瓶中的培养液 • 2.加入0.5-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液
能覆盖整个瓶底为准），然后两种方式处理： 一种30S后，吸去消化液，剩余的酶液继续作 用，后在相差显微镜下观察。第二种，不吸去 消化液，静置2-10 min（显微镜下动态监测）。
• 在倒置镜下观察被消化的细胞，如果胞质回缩，细胞 变圆，相互之间不再连接成片.
（1）细胞计数
• 将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖 片盖在计数板上。
• 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘， 使悬液充满盖片和计数板之间。
• 静置3分钟。 • 镜下观察计数
细胞培养技术进阶教程
细胞浓度的计算：
• Volume (体积) • =長 x 寬 x 深度 • = 1 mm x 1 mm x 0.1 mm • = 0.1 mm3 • = 1 x 10-4 cm3 (ml)
• 2、取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量 冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml)
• 3、加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细 胞名称和冷冻日期。
细胞培养技术进阶教程
冷冻保存要点：
– 冷冻过程要缓慢。4℃ 30－60 分钟→-20℃ 30 分钟 →-80℃ 16－18 小时（或过夜）→ 液氮长期保存
细胞培养技术进阶教程
(2)细胞系(株)换液:
• 条件合适时生长迅速，过夜就变黄，可进 行全量换液。这种情况下，最好减少细胞 接种数，延长换液的时间。
• 方法:
细胞培养技术进阶教程
2、细胞形态变化：
• 生长良好细胞：透明度大，折光性强，轮 廓不清。
• 生长状态不良时，细胞折光性变弱，轮廓 增强，胞质中常出现空泡，脂滴，颗粒样 物质，细胞之间空隙加大。
细胞。
细胞培养技术进阶教程
细胞运输：
• （1）长距离运输（几天） • 选择生长良好细胞，换细胞液，补充新培养液至
瓶颈部，保留微量空气，拧紧瓶盖， • 瓶子口用胶密封，并用棉花包，放在携带者贴身
口袋带回，或用包装盒空运。 • （2）短距离运输（几小时） • 去掉大部分生长液，仅留少量液体覆盖单层细胞，
细胞培养技术进阶教程
细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。 洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单胞菌 属，是植物病原菌。
细胞培养技术进阶教程
白色念珠菌污染
细胞培养技术进阶教程
真菌感染
细胞培养技术进阶教程
支原体污染电镜照片, 煎蛋状和其他形状
细胞培养技术进阶教程
3、细胞传代（贴壁细胞）：
防止细胞干燥，将细胞附着面朝上带回。 • （3）液氮冻存运输
细胞培养技术进阶教程
5、细胞活力检测
• 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细 胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活 力。
• 应用：由组织中分离细胞 复苏后的细胞 药物筛选
• 方法：细胞计数+台盼兰染色
•
MTT法
细胞培养技术进阶教程
细胞培养技术进阶
细胞培养技术进阶教程
细胞培养技术
1、细胞原代培养 2、细胞生长状况的观察 3、细胞传代 4、细胞冻存、复苏和运输 5、细胞活力检测 6、细胞周期检测 7、细胞凋亡检测 8、细胞凋亡的流式分析
细胞培养技术进阶教程
1、细胞原代培养
• 原代培养也叫初代培养，是从供体取得组 织细胞后在体外进行的首次培养。