-
-
-
--
细胞
病变 ++++ ++++ ++++
++
++
-
-
-
--
❖ Reed-Muench法计算TCID50，举例如下：
病毒稀释度
病变数/ 接种数
累积数（孔）
有病变
无病变
累计病变细胞孔比例ຫໍສະໝຸດ 百分比（%）10-3
8/8
18
0
18/18
100
10-4
6/8
10
2
10/12
83
10-5
4/8
4
6
4/10
40
注意事项
❖ 不同的病毒应选用各自敏感的细胞。 ❖ 接种病毒前细胞单层必须良好。 ❖ 接种病毒时应从低浓度向高浓度方向加样，防
止跳管现象。
二、干扰素效价测定（一）
（8组做此实验）
实验目的
❖ 掌握微量细胞病变抑制法测定干扰素效价的基本
步骤以及结果分析。 ❖ 熟悉常用生物制品生物学活性测定的实际意义。 ❖ 了解影响结果的常见因素。
实验原理
❖ 何谓干扰素？
病毒或其他干扰素诱生剂作用于人或动物的白 细胞、T细胞或成纤维细胞后，刺激细胞产生 的具有抗病毒、抗肿瘤和调节免疫功能的一类 小分子糖肽，统称为干扰素。具有间接的广谱 抗病毒作用。
❖ 为了进一步确定人工方法制备的干扰素的生物学 活性，需进行体外抗病毒试验测定，即干扰素效 价的测定。
-：表示无细胞病变
+：表示1%～25%的细胞有病变 ++：表示26%～50%的细胞有病变 +++：表示51%～75%的细胞有病变 ++++：表示76%～100%的细胞有病变
病毒稀释度 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 C
细胞
病变 ++++ ++++ ++++ ++++ ++
PBS， VTP ❖ 材料：细胞板，微量移液器，tip头
实验步骤
❖ 细胞的制备与培养(已完成） ❖ 病毒的稀释与接种 ❖ 结果观察与计算:
➢ 结果的记录时间为感染细胞的病变不再进展为止，不同 的病毒不一样，本实验所用的水泡性口炎病毒（VSV) 增殖较快，一般48小时左右即可观察染色。
➢ 计算方法常用的有Reed-Muench法。
复孔 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
❖ 结果观察：于培养后的不同时间，18h、24h、48h在倒置显
微镜下观察细胞病变情况，当病变不再发展时记录结果，细 胞病变程度表示法如下：
10-3 、 10-4 、 10-5 、 10-6 、 10-7。
稀释病毒液
管号 DMEM维持液
待测VSV 稀释度
1
2
3
4
5
6
7
1.8ml 1.8ml 1.8ml 1.8ml 1.8ml 1.8ml 1.8ml
0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
❖ 病毒接种：将长好单层细胞的培养板各孔培养液全
部倾弃，用微量加样器将各稀释度VSV病毒液加入
相应孔中，每孔100μl，每个稀释度加2孔。同时设
细胞对照孔，不加病毒液，只加维持液。37℃，
5%CO2培养箱中培养。
DMEM维 持液
1
2
3
4
5
6
7
8
9
C
试验孔 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl
❖
=(-4)+(- 0.767)=-4.767
❖ 则该病毒的TCID50=10- 4.767/0.1ml，即此病毒的10- 4.767的浓度（1∶63000） 0.1ml接种一组细胞孔后，可使50%的细胞感染病变。
❖ 如何计算200 TCID50？ ❖ 200 TCID50=63000/200=315，将病毒作315倍稀释时即得200 TCID50的病毒液。
❖ 干扰素效价一般定义为：若1ml干扰素标本的最高 稀释度仍能保护半数细胞（50％）免受“攻击病 毒”损害，则该稀释度的倒数即为干扰素的效价， 表示为单位/毫升。
❖ 测定干扰素效价的方法有多种，最常用的是“细胞病变抑制 法”（Method of Cytopathic effect inhibition assay）。此法 的主要优点是操作简便，易于掌握，结果可靠，故已成为目 前各实验室的常规。亦可用“放射化学测定法”、“染料摄 入测定法”。
❖ TCID50滴定法是50%（50% endpoint)终点法测定 病毒滴度的方法之一，是将病毒悬浮液经一系列稀 释后，接种至培养成的单层细胞，将每个稀释度造 成的细胞病变做成曲线，找出造成50%细胞病变的 终点稀释度。
实验材料
❖ 细胞：Hep-2细胞株 ❖ 病毒：水泡性口炎病毒（VSV) ❖ 试剂：DMEM培养液(或RPMI1640)，小牛血清，
❖ 制备细胞(已经完成）：按传代细胞培养的方法制备Hep-2
细胞悬液，细胞浓度约为1× 106/ml。用微量移液器将细胞 悬液加入40孔板微孔中，每孔100μl，37℃，5%CO2培养箱 中培养24h，形成良好的单层。
❖ 病毒稀释：用含3%小牛血清的DMEM(或RPMI1640）维持 液将待测病毒VSV作连续10倍稀释，依次为10-1、 10-2 、
优选细胞培养技术实验篇四
一、VSV TCID50滴定
实验目的
❖ 掌握病毒TCID50滴定的基本原理和计算方法 ❖ 熟悉病毒TCID50的应用
实验原理
❖ 多数病毒感染体外培养的细胞后，常引起细胞形态 学改变，如细胞团缩、裂解、细胞肿大或脱落等，
这种改变称为病毒的致细胞病变效应（CPE)。
❖ TCID50 （50%tissue culture infectious dose) 是病毒 毒力的传统表示法， 即能在50%组织细胞培养孔或 试管内引起细胞病变所需的病毒最高稀释度。
10-6
0/8
0
14
0/14
0
由上表可知病毒的TCID50介于10-4与10-5两个稀释度之间，两稀释度之 间的距离比计算如下：
❖
高于50%病变的百分数-50%
❖ 距离比例= -
×lg稀释倍数
❖
高于50%病变的百分数-低于50%病变的百分数
❖
❖
83-50
❖
=-
×lg10=-0.767
❖
83-40
❖ lgTCID50=高于50%病变的稀释度的对数+距离比例