本实验分为空白组和模型组 。其中空白组不施加任 何药物处理； 而模型组分为 4 个不同浓度组， 即终浓度 300 ， 500 ， 700 μmol / L。 每组设 12 个复孔。 分别为 100 ， 取对数生长期的 PC12 细胞， 将其配成单细胞悬液， 以
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5 ˑ 10 4 / mL 接种于 96 孔培养板。 连续培养 24h 后换 + 液， 在每孔中分别加入不同浓度的 MPP 稀释液， 使它 300 ， 500 ， 700 μmol / L。 再分别继 的终浓度分别为 100 ， 24 ， 48h 后， 续培养 12 ， 置于倒置显微镜下观察细胞的 形态学 变 化。 每 孔 加 入 MTT 溶 液 （ 5mg / mL ） 20 μL， 37ħ 孵育 4h 。终止培养后小心吸空培养基， 每孔加入 150 μL DMSO， 振荡 10min ， 使结晶充分溶解。 酶标仪 检测每 个 孔 在 490nm 处 吸 收 值 （ OD 值） （ 参 考 波 长 630nm） ， 计算细胞存活率。细胞存活率% = 实验组光 吸收值 / 对照组光吸收值 ˑ 100% 。 1. 4 流式细胞术检测细胞凋亡率 实验分为空白组、 模型组。其中空白组不施加任何药物处理； 模型组加 + 入终浓度为 300mol / L MPP 。 每组设 3 个平行样本。
+ 明 MPP 可抑制 PC12 细胞存活率， 在终浓度为 100 700 μmol / L 范围内， 此作用存在量效关系和时效关系。 + 综合 诸 多 因 素 考 虑， 后 续 实 验 MPP 终 浓 度 均 采 用 300 μmol / L， 作用时间选用 48h。
图1 表1 MPP + （ μmol/L） 空白组 100 300 500 700
+ 关键词： MPP ； PC12 细胞； 氧化应激 中图分类号： R － 33 文献标识码： A
文章编号： 1000 － 1719 （ 2010 ） 11 － 2243 － 03
The Experimental Research on the Oxidative Stress Damage of PC12 Cells Induced by MPP + An Lifeng1 ， LIU Shumin2 ， DONG Yang2 ， TANG Bo2 （ 1. Institute of Traditional Chinese Medicine， Jiamusi 154007 ， Heilongjiang， China； 2. University of Chinese Medicine， Harbin 150040 ， Heilongjiang， China） Abstract： Objective： To discuss the oxidative stress damage in MPP + induced PC12 cells， and to explore its mechanism． Methods ： PC12 cells were induced by MPP + at different concentrations and intervals， cell survival rate was detected by method of MTT． cell apoptosis rate was detected by Flow cytometry， and the contents of LDH、 NO、 NOS、 MDA and and activity of SOD were inspected by UV spectrophotometer． Results： When the concentration of MPP + reached to 300 μmol / L after 48 hours， the survival rate of PC12 cells was obviously reduced， cell apoptosis rate was increased， the contents of LDH、 NO、 NOS、 MDA and and activity of SOD were all enhanced， That was statistical significance （ P ＜ 0. 05 ） ． Conclusion： The experiment certified that MPP + can inand its mechanisms maybe implement through the increasion of the leakage of LDH and induce PC12 cell oxidative stress injury， creasing the contents and of NO、 NOS、 MDA， decreasing the activity of SOD and all the above were functioned in increasing apoptosis in PC12 cells． Key words： MPP + ； PC12 cells； oxidative stress s disease ， PD） 是中老年常见 帕金森病（ Parkinson ’ 的慢性神经系统退行性疾病， 患病率和致残率均较高， 是危害老年人健康的主要疾病之一 。其特征性临床表 现为静止性震颤、 肌强直、 运动迟缓和姿势不稳 。多项 PD 病人机体处于氧化应激状态， 氧化应激 研究表明， 反应和自由基损害在帕金森病等神经变性疾病中起重 ［1 － 2 ］ + 。本研究采用细胞培养的方法， 要作用 应用 MPP 作用于 PC12 细胞以制备 PD 体外氧化应激模型， 观察 MPP + 对 PC12 细胞的氧化应激反应， 并简单探讨其机 理， 以便为下一步的药物筛选和新药研发提供可靠的
+ 要： 目的： 考察 MPP 诱导 PC12 细胞氧化应激损伤作用， 并探讨其机制。 方法： 以不同浓度、 不同作用时间的 MPP 作用于 PC12 细胞， MTT 法检测细胞存活率， NO、 NOS、 流式细胞仪测细胞凋亡率， 紫外可见分光光度计测 LDH、
摘
+
MDA 含量和 SOD 活性。结果： MPP + 终浓度达到 300 μmol / L 时， 作用 48h 后可明显降低 PC12 细胞存活率（ P ＜ 0. 001 ） ， + NO、 NOS、 MDA 的含量和降低 SOD 活性， 提高细胞凋亡率（ P ＜ 0. 01 ） ， 增强 LDH、 有统计学意义（ P ＜ 0. 05 ） 。 结论： MPP 能诱导 PC12 细胞氧化应激损伤， 其作用机制可能是通过增加 PC12 细胞 NO 和 NOS 含量， 引起胞内 SOD 的活性降低， 从 。 而引起脂质过氧化物增加来损伤多巴胺能神经细胞的
1500r / min 离 置 CO2 培养箱中培养 48h 后， 胰酶消化， 心 5min ， 弃上清取沉淀， 用 PBS 缓冲液漂洗 2 次， 加入 500 μL Buffer 重悬细胞， 过滤， 再加 5 μL Annexin V － FITC 和 10 μL PI 染液， 室温避光温育 5min ， 流式细胞 仪检测， 所有数据均经 CellQuest 软件收集处理。 1. 5 LDH NO NOS 的测定 实验分组同上， 每组设 3 。 PC12 0. 5 ˑ 10 5 / mL 个复孔 将对数生长期的 细胞以 接种于 6 孔板中， 接种 1mL， 培养 24h 后模型组加入 MPP + ， 使它的终浓度为 300 μmol / L， 空白组加入等体 置 CO2 培养箱中培养 48h 后， 收集培养 积的培养液， NO、 上清， 分 3 份冻存备用。测时取上述样本按 LDH、 NOS 试剂盒操作， 用 756 紫外可见分光光度计测定其 吸光度。 1. 6 SOD MDA 的 测 定 分 组 和 处 理 方 法 同 前。 PC12 细胞 给 予 药 物 处 理 后， 用 胰 酶 消 化 收 集 细 胞， 3000r / min 离心 5min ， 并用 PBS 液洗 2 次， 然后定量加 入 1mL 含有 0. 05mM EDTA 的冰 PBS 超声裂解细胞， 4ħ ， 10000r / min 离 心 然后 放 入 低 温 超 速 离 心 机 中， 60min 。离心后， 取 上 清 液 测 定 各 组 MDA 的 含 量 和 SOD 的活性。 细胞蛋白定量应用考马斯亮兰标准定 量方法。各样本吸光度值应用可见光 － 紫外光分光光 度计测定。 珋 1. 7 统 计 学 处 理 各 组 数 据 均 用 x ʃ s 表 示， 采用 SPSS 软件进行组间 t 检验， P ＜ 0. 05 为差异有统计学 意义。 2 2. 1 结 果 MPP + 对 PC12 细胞形态的影响 从光镜观察可 以看出空白组 PC12 细胞状态良好， 梭型明显， 细胞分
5 将对数生长期的 PC12 细胞以 2 ˑ 10 / mL 接种于培养 + 瓶中， 接种 1mL， 培养 24h 后模型组加入 MPP ， 使它 的终浓度为 300 μmol / L， 其它组加入等体积的培养液，
辽宁中医杂志 2010 年第 37 卷第 11 期 0. 01 ） 。在作用 48 h 后， 细胞存活率下降更为明显， 不 + 同浓度的 MPP 组均有极显著性差异（ P ＜ 0. 001 ） 。 表
实验依据。 1 材料和方法 1. 1 主要材料
PC12 细胞购自中科院上海生物细胞 + 研究所； 1 － 甲基 － 4 － 苯基 － 吡啶离子（ MPP ） ， 四甲 基偶氮唑盐（ MTT ） 购自美国 sigma 公司； DMEM 培养 基购自 GIBCO 公司产品； 胎牛血清（ NBS ） 购自杭州四 美国 philippines 公司； 酶标仪， 季青公司； 倒置显微镜， 塞默飞世尔（ 上海） 仪器有限公司； 流式细胞仪， 美国 BD 公司。