原料中羟脯氨酸含量的测定
1.材料和试剂
1.1材料
秦宝雪花牛牛蹄筋：陕西秦宝牧业有限责任公司。
秦宝普通育肥牛、雪花牛肺：陕西秦宝牧业有限责任公司。
秦宝雪花牛棒骨：陕西秦宝牧业有限责任公司。
1.2试剂
所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水，或相同浓度的水。
1.2.1硫酸溶液[c(H2SO4)≈3mol/L]
量取750mL水于2L的容量瓶中，在搅拌下缓慢加入320mL浓硫酸（ρ20=1.84g/mL）。
冷却至室温后用水定容。
1.2.3缓冲溶液（PH=6.8）
包括下列组分：
a）26.0g一水柠檬酸（C6H8O7·H2O）；
b）14.0g氢氧化钠；
c）78.0g无水乙酸钠[Na(CH3CO2)]。
用500mL水溶解上述试剂并转入1L的容量瓶中，加入250mL 正丙醇，用水定容。
该溶液于4℃暗处可稳定保存几周。
1.2.4氯胺T溶液
称取1.41g三水·N-氯-对甲苯磺酰胺钠盐（氯胺T），用100mL 缓冲溶液溶解。
临用前配制。
1.2.5显色剂
称取10.0g对甲氨基苯甲醛，用30mL高氯酸溶液[70%（质量分数）]溶解，缓慢加入65mL异丙醇。
临用前配制。
1.3羟脯氨酸标准溶液
1.3.1标准储备液
称取50mg4-羟基-α-吡咯甲酸（羟脯氨酸）于100mL容量瓶中，用水溶解，加一滴硫酸溶液（1.2.1），用水定容。
该溶液于4℃下可稳定存放1个月。
1.3.2标准工作液
移取5.00mL上述标准储备液至500mL容量瓶中，用水定容。
分
别吸取该溶液10.00mL、20.00mL、30.00mL、40.00mL于100mL容量瓶中，用水定容，所得标准工作液浓度一次为0.5µg/mL、1.0µg/mL、
1.5µg/mL、
2.0µg/mL。
临用前配制。
2.仪器和设备
3.试样制备
用刀将原料在冷冻时（0℃以下）切成小块（约0.5cm3，边长约为8mm）。
将切好的试样装入密封样品盒中，或用耐热塑料袋真空包装，70℃以上保温30min后，冷却。
用绞肉机将试样均质。
将试样装入密封的容器里，防止变质和成分变化。
试样应在均质化后24h内尽快分析。
4.分析步骤
4.1试样
称取4g试样（精确至0.001g）于烧杯中，避免试样粘在烧杯壁上。
4.2水解
4.2.1量取30mL±1mL硫酸溶液，加入烧杯中，用培养皿盖住，于105℃干燥箱内恒温16h。
4.2.2趁热将水解产物转移至250mL容量瓶中。
用10mL硫酸溶液分三次洗涤烧杯，合并至上述容量瓶中。
用水定容，摇匀。
然后将其过滤至三角瓶中。
4.3测定
4.3.1用移液管移取5mL的上述滤液至250mL容量瓶中。
4.3.2移取4.00mL上述溶液于比色管中，加入2.00mL氯胺T试剂，混合后于室温下放置20min±1min。
4.3.3加入2.00mL显色剂于比色管中，充分混合，用塞子将比色管封
口。
4.3.4将比色管迅速放入60℃水浴中，加热20min。
4.3.5取出比色管，用流动水冷却比色管至少3min，在室温下放置30min。
4.3.6空白测试
用水代替稀释溶液，重复4.3.2至4.3.5的操作。
后于558nm±2nm 处用分光光度计测定吸光度值。
4.3.7从4.4所得标准曲线查得水解产物中羟脯氨酸的含量。
4.4标准曲线
4.4.1用4.00mL羟脯氨酸标准工作液一次代替稀释后的水解产物，进行4.3.2至4.3.6的操作。
4.4.2以标准工作液的吸光度为纵坐标，以相应的浓度为横坐标，绘制标准曲线。
管号0 1 2 3 4 标品L羟脯氨酸含量（ug/ml）0 0.5 1.0 1.5 2.0
0.457
吸光度值（A）0 0.121 0.232 0.232
试样中羟脯氨酸的含量按下式计算：
X=6.25c/（m×V）
式中：
X —试样中羟脯氨酸的含量，%；
c —由标准曲线得到的试样溶液中羟脯氨酸的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL ）；
m —试样质量，单位为克（g ）；
V —从250mL 容量瓶中吸取滤液的体积，单位为毫升（mL ）； 计算结果保留至小数点后两位。
6.实验结果
试验 羟脯氨酸含量（%）
范围（%） 1肺11625 0.3102
0.2911～0.3860
2肺11626 0.3373 1肺5865 0.3860 2肺5866 0.3334 1肺5840 0.2911 2肺5840 0.3406
0.2920～0.4293 1肺9804 0.2922 2肺9804 0.3700 1肺9828 0.2989 2肺9828 0.3308 1肺9836 0.3162 2肺9836 0.3831 1肺7953 0.4285 2肺7953 0.4293 1肺7975 0.3405 2肺7975 0.2920 1肝脏9836 0.0518
0.0518~0.0642 2肝脏9836 0.0642 1蹄筋 1.3146
1.3146~1.3627
2蹄筋 1.3627 棒骨
1.3577
1.3577 7.讨论
原料胶原蛋白的含量
猪皮[2]荣昌成猪74.12%±0.99 荣昌乳猪66.78%±0.36
鸡肉[3]农家饲养的土鸡0.22%市场购买后再于农家饲养0.15%鱼皮[5]鱿鱼皮0.823% 狗鲑鱼皮2.247%
牛皮[1]26%
林蛙皮[4]26%
猪肺[6] 3.08%±0.12
原料羟脯氨酸的含量
猪皮[7]23.18mg/g
8.参考文献
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[3] 罗凤莲,夏延斌,欧阳建勋,王燕,夏晓凤.分光光度法测定鸡肉中的羟脯氨酸含量.食品科技,2010, 35(1): 122-124.
[4] 郑淼,周亚丹,赵敏.东北林蛙皮中胶原蛋白含量的测定及提取工艺.东北林业大学学报,2008,36(7): 81-83.
[5] 郭恒斌,曾庆祝,闫磊,王毳. 分光光度法测定鱼皮中的羟脯氨酸含量.现代食品科技,2007,23(7):81-83.
[6] 李小勇, 2007. 猪肺中胶原蛋白的提取及理化特性研究. 西南大学硕士学位论文.
[7] 蓝蔚青,王川,李燕,方欣,王庆红,周培根.猪皮中羟脯氨酸含量的测定.中国食物与营养,2006, (10)：38-40.。