固定化细胞技术进行乳酸发酵生产的研究
摘要:文章以乳酸菌为菌种,活化培养后固定于海藻酸钠、琼脂、明胶-戊二醛三种载体上,分别选取不同的接种量、胶珠直径、载体浓度、CaCl2浓度等因素设计单因素实验和正交实验,以36 h为时间范围恒温下进行发酵;通过还原糖量和酸度的测定,衡量不同条件对乳酸产量的影响,最终选出最佳发酵工艺条件。
关键词:乳酸发酵;固定化细胞;凝胶包埋法
中图分类号:TQ921 文献标识码:A 文章编号:1000-8136(2010)27-0146-02
和游离细胞培养发酵相比,固定化细胞技术具有细胞密度高、反应速度快、耐毒害能力强、微生物流失少、产物分离容易、可反复使用、能实现连续操作等优点[1],有利于提高生物反应器内微生物细胞的浓度和纯度,保持高效菌种,因此可大大提高生产能力[2]。
近年来,固定化细胞技术以其低成本和可操作性强而备受瞩目,已成功地应用于生产微生物酶和其他蛋白质,此技术用于生产乳酸国内外研究尚不多见。
乳酸是自然界三大有机酸之一,广泛应用于食品、医药、印染、化工和生物可降解材料等领域[3]。
本实验采用凝胶包埋载体中的海藻酸钙、琼脂糖和明胶-戊二醛三种载体[4]对乳酸菌进行固定化,恒温下发酵培养,通过工艺参数的比较,找出最适合乳酸发酵的固定化细胞制作条件。
1材料与方法
1.1实验材料
保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌粉,由河南花花牛乳业有限公司提供;MRS液体培养基(g/L):蛋白胨10,牛肉膏10,酵母浸粉5,葡萄糖20,乙酸钠2,柠檬酸氢二胺2,磷酸氢二钾2,MgSO4•7H2O 0.58,MnSO4•H2O 0.25,Tween 80 1 mL,121 ℃高压蒸汽灭菌20 min;其它试剂均为分析纯级。
1.2实验方法
1.2.1海藻酸钙固定化乳酸菌细胞
采用海藻酸钙法[5]。
将菌种移入种子培养基,于37 ℃下静置培养20 h,离心洗涤菌体,接入海藻酸钠溶液中充分混匀,用注射器将此混合液滴入到CaCl2溶液中,形成的海藻酸钙凝胶珠冲洗备用。
1.2.2琼脂固定化乳酸菌细胞
将溶化的琼脂溶液与培养20 h乳酸菌发酵液混合均匀,琼脂浓度为3 %;用注射器将此混合液滴入上层是液体石蜡、下层是水的量筒中;用无菌纱布滤出颗粒,无菌水冲洗三次,备用。
1.2.3明胶-戊二醛固定化乳酸菌细胞
将明胶溶液与培养20 h乳酸菌发酵液混合均匀,明胶的最终浓度为10%左右;直接在混合液中加入戊二醛[6],搅拌均匀,倒入灭菌培养皿中凝固;将凝胶切成3×3×3 mm的小方块,用无菌水冲洗备用。
1.2.4DNS法测定还原糖的含量[7],酸碱滴定法测定乳酸的含量[8]。
2结果与分析
2.1固定化方法对发酵产酸耗糖的影响
固定化载体分别选用2%海藻酸钠、3%琼脂糖和10%明胶-戊二醛,37 ℃发酵36 h,乳酸和还原糖随时间变化的情况见图1、图2。
结果表明,海藻酸钙包埋的细胞消耗还原糖的速度和产乳酸的速度高于使用琼脂和明胶-戊二醛载体,故海藻酸钙为最佳包埋载体。
图1固定化方法对发酵乳酸产量的影响图2固定化方法对还原糖含量的影响
2.2载体浓度对乳酸菌固定化效果的影响
选取海藻酸钠浓度分别为1%、1.5%、2%、2.5%和3%,结果见表1。
可知,随着海藻酸钠浓度的增加,溶液的黏度逐渐增大,相同挤压孔径下,挤压越来越困难。
当海藻酸钠浓度为 1.0%时,形成的胶珠强度较弱,且易破壁,稳定性低;当海藻酸钠浓度为3.0%时,稳定性较好,但由于溶液黏度较高,固定化成球困难,且形成的固定化胶珠直径较大,硬度过强,不利于菌体生长。
因此,2.0%为最佳海藻酸钠固定化细胞浓度。
表1海藻酸钠浓度对乳酸菌固定化效果的影响
海藻酸钠浓度/ % 胶珠强度成珠难易胶珠形状
1.0 较弱,易破裂较易偏球形
1.5 较弱,易破裂易球形
2.0 适中,弹性较好适中球形
2.5 适中,弹性较好较难球形
3.0 较硬,弹性较差难椭球形
图3接种量对固定化发酵乳酸的影响
2.3接种量对固定化发酵产酸的影响
在固定化细胞量5%～20%范围内,每5%为一间隔接种,比较其对产酸的影响。
由图3可知,固定化细胞量为15%、20%和25%时乳酸产量较高,因此固定化细胞最适量为15%～25%。
2.4氯化钙浓度对固定化发酵的影响
海藻酸钠经发酵指标测定为最优载体,则发酵效率就要考虑CaCl2浓度的影响,在3%～7%范围内,每1%为一间隔制作不同固定化颗粒,结果表明,CaCl2浓度在3 %时,所制作的固定化细胞形状均匀,软硬适中,具有弹性。
2.5凝胶颗粒大小对固定化发酵的影响
经测量,枪头口端直径的大小与形成的胶粒的直径关系见表2,用不同直径枪头制成不同大小的固定化细胞胶粒,37 ℃发酵36 h。
由图4、图5可知,胶珠颗粒直径对发酵的产酸和耗糖速度有较大影响,当颗粒直径为2.5 mm时,产酸和耗糖速度快,发酵周期短。
胶珠直径越大,越不利于传质,造成胶珠内部的细胞营养供给不足,不利于发酵的进行。
表2枪头直径和胶粒直径对照表
枪头直径 1 mm 1.5 mm 2 mm 2.5 mm 3 mm
胶粒直径 1.0～1.5 mm 1.5～2.0 mm 2.0～2.5 mm 2.5～3.0 mm
3.0～3.5 mm
图4凝胶颗粒大小对发酵图5凝胶颗粒大小对发酵
36 h产酸的影响36 h耗糖的影响
2.6正交实验
在乳酸菌的固定化过程中,海藻酸钠浓度决定着胶珠的成型和反应性能。
浓度太低不能成珠,浓度过高挤珠困难,还会使得壁材过厚降低菌种与外界发酵的灵敏度;接种的胶粒量直接影响到接种的菌量;而胶珠颗粒直径对发酵的产酸和耗糖速度也有较大影响。
以上三个因素设置三水平进行正交试验,因素水平见表3。
在发酵的第36 h测定固定化细胞的产酸量。
由表4可看出,最优条件为海藻酸钠浓度2%,接种量15%,枪头直径2 mm,即胶粒直径为2.0～2.5 mm。
3结束语
本文采用明胶-戊二醛、琼脂、海藻酸钠作为载体,制作乳酸菌固定化细胞发酵生产乳酸。
结果表明海藻酸钙固定化乳酸菌发酵生产乳酸是一种比较理想的固定化方法。
综合单因素实验和正交实验的结果,确定了经优化后的适合于乳酸发
酵的固定化细胞最佳条件:海藻酸钠浓度2%、接种量15%、使用凝胶珠的直径2.0～2.5 mm,氯化钙浓度5%。
参考文献
1 Y. Kourkoutas, A. Bekatotorou, IM.banat, et.al. Immobillization technologies and support meterials suitable in alcohol beverages production:a review[J]. Food Microbioloyg, 2004(21): 377～397
2 闫志明、普红平等.生物固定化技术研究及应用评述[J].四川化工,2004.1:12～15
3 张刚.乳酸细菌:基础、技术和应用[M].北京:化学工业出版社,2007.1
4 何延青、刘俊良等.微生物固定化技术与载体结构的研究[J].环境科学,2004.6:101～104
5 郝艳丽、曹德玉等.乳酸菌固定化初探[J].食品研究与开发,2004.10.第25卷
(5):89～91
6 韩斌.指导老师:李莹、蔡宝立、潘继伦.包埋法固定化微生物问题初探.南开大学环境科学与工程学院环境科学系,2003.4.5
7 韩雅珊.食品化学试验指导[M].北京:中国农业大学出版社,1992
8 金纪元、殷家骏.乳与乳制品卫生检验手册[M].北京:人民卫生出版社,1987。