各基因突变检测方法比较
参数
测序
qPCR
一代测序 ~20%
已知和未知突变 类型
二代测序 5%~10%（TBD）
已知和未知突变 类型
ARMS 1%~5%
已知突变类型/ 最多41种突变
灵敏度
突变类型覆盖
检测时间
数据分析 检测无效率
~3天
复杂 高
2天~3天
复杂 低
<2 小时
简单/有些可直 接出报告 低
cobas EGFR Mutation Test. CE-IVD Package Insert. Roche Molecular Systems, Inc., USA. 2011. 《癌症进展》2012 年1 月第10 卷第1 期
第二代测序
焦磷酸测序
优势 相比一代灵敏度高，特异性高
测序读长长 能得到具体突变类型 不足 测序仪价格昂贵
试剂耗材复杂 检测时间长（ 2天~3天） Roche 454 GS FLX / Junior
ABI 5500 Genetic Analyzer
罗氏cobas EGFR使用ARMS方法检测突变
等位基因特异扩增，荧光探针检测
cobas BRAF突变检测
主要用途与临床价值
主要用途 • 福尔马林固定、石蜡包埋人黑色素瘤组织 DNA BRAF V600突变检测
临床价值 • 帮助选择适合威罗菲尼片治疗的黑色素瘤患 者
实时荧光定量PCR仪发展简史
罗氏不断打破记录将创新的PCR技术推向市场
cobas z 480上市
LC480 II 上市 LC480 上市 罗氏推出COBAS Amplicor PCR诊断行业金标准
结果解读
第一代测序
直接测序法，Sanger测序
优势
技术成熟成本低 未知突变序列 单向反应的读序能力较长
不足 工作量大，时间长（3天） 实验复杂 灵敏度低，特别对于片段化的DNA 3500 毛细管电泳基因分析仪 3130 基因分析仪
无效率高
“我想在将来，直接测序法是金标准的说法 要改变了。” - 吴一龙教授，CSCO主席
EURTAC临床研究
cobas检测更加准确、快速、可靠
• 无效率方面，cobas EGFR检测比sanger测序法更低（8.8% VS 15.6%）
• cobas EGFR检测与焦磷酸测序的相关性很高（96.3%）
• cobas EGFR检测24h内出结果，但sanger测序法3天后才出结果
Mok 等人, ASCO 2013
艾德 :Adx KRAS
-
鉴别EGFR抑制剂治疗无效 的晚期结直肠癌患者
检测12，13，61密码子
12D 12V 12C 12密码子 12A 12S 12R
-
12F 13D
13C 13R 13密码子 13S 13A 13V 13I
<0.1% 18.40%
0.50% 0.30% 0.10% 0.10% 0.10% 0.10%
cobas EGFR突变检测 用途与临床价值
主要用途 • NSCLC肿瘤组织DNA中EGFR基因的外显子18–21中突 变的定性检测和41种突变位点的识别 临床价值 • 晚期NSCLC患者如存在EGFR突变，则对抗 EGFR的 TKI（特罗凯 ，易瑞沙 ）治疗疗效好
在Tarceva研究中经过临床验证
* in CTONG 0806
第二代测序
焦磷酸测序
1. 特异的测序引物和单链DNA模板结 合, 加入一种dNTP 2. DNA 聚合酶的作用下，单个 dNTP与 模板的下一个碱基配对，同时释放出 一个分子的焦磷酸(PPi)
焦磷酸测序（第二代测序）
3. 在ATP硫酸化酶的作用下，PPi和APS 结合形成ATP 4. 在荧光素酶的催化下，生成的ATP 又可以和荧光素结合形成氧化荧光素 ，同时产生可见光，被CCD捕捉 5. Apyrase降解剩余的dNTP和残留的少量 ATP 6. 加入另一种dNTP重复2-5步骤
肿瘤分子诊断技术新进展
肿瘤的个体化治疗
肿瘤突变检测方法 罗氏肿瘤分子诊断解决方案
肿瘤的个体化医疗（PHC）
A tailored approach to improve treatment outcomes
伴随诊断的目的
• 能帮助指导医生鉴别肿瘤患者特质，使用 合适的药物进行治疗
NSCLC: 从病理分型到分子分型的演变
没有发现外显子19， 21，18点突变
特罗凯和易瑞沙是一种EGFR酪氨酸酶抑制剂(TKIs)，是为肺癌患者延长生存期的 靶向治疗药物
肿瘤的个体化治疗
肿瘤突变检测方法 罗氏肿瘤分子诊断解决方案
肿瘤分子病理检测
关注的方面：方法平台的建立以及实验室质量控制
仪器与结果解读
检测平台 分析与报道
Ins Ins Ins Ins Ins
6240
Del Del
Del Del Del Del Del
12387
Del Del
Del Del Del Del Del
13550
L858R L858R
6224
6252
6225
6210
12386
6241
12429
G719C
6253
12370
26038
13552
罗氏分子系统 发明实时定量PCR仪 Kary Mullis 罗氏获得全球 PCR专利权 发明PCR技术
1985
1991
1993
1995
1998
2005 2009 2011
罗氏分子诊断产品cobas® z 480扩展应用
肿瘤突变检测 KRAS：鉴别EGFR抑制剂治疗无效的晚期结直肠癌患者 EGFR：帮助NSCLC患者选择合适的治疗 BRAF：帮助晚期黑色素瘤患者选择合适的治疗 开放式PCR平台：结果可靠，快速高效，智能灵活
NSCLC不再是一个疾病，而是一组疾病，需要分类诊断治疗
NSCLC
EGFR突变具有种族差异
TKI是上帝赐与东方人的礼物！
EGFR突变高发人群：东亚人群、女性、腺癌、不抽烟者
全球人群 ,% 东亚人群 ,%
全部 不吸烟者
腺癌 女性
19 54
42 46
30 60
49 58
中国NSCLC患者中EGFR突变率约40%！ - 更多人会从TKI治疗中获益 - 临床对EGFR检测的需求大
61H** 61L
61密码子 61R 61K 61E 61P
0.50% 0.10%
0.10% 0.10% <0.1% <0.1%
**两个 61H 突变（CAG和 CAC）
1COSMIC database (v65), accessed June 2013; 2cobas® KRAS Mutation Test. CE-IVD PI 2013; 3therascreen® KRAS PCR Kit CE-IVD Handbook 2012
肿瘤的个体化治疗
肿瘤突变检测方法 罗氏肿瘤分子诊断解决方案
荧光PCR法检测EGFR突变的位点 最多覆盖41种突变类型
外显子18
G719A G719S
6239
外显子19 外显子19 外显子19
Del Del
Del Del Del Del Del
6223
外显子20 外显子21
T790M S768I
12376
12382
13556
12385
13428
12369
12422
12416
12378
12384
6220
18427
12377
6255
13551
23571
13558
Del
Del
12383
Del
Del
12367
Del
12403
12678
12419
Del
Del
6218
Del
12728
激活性突变(TKI敏感性)： 19缺失，21点突变，18点突变 耐药性突变(TKI耐药性)： 外显子20突变
cobas 4800全自动核酸提纯及荧光 PCR分析系统
cobas z 480
HPV ： 一份样本，一次检测，3种结果
宫颈癌筛查，风险分层管理
CT/NG： CT/NG的筛查和诊断
标本类型包含分泌物、尿液
未来产品： EGFR Blood, PDL1……
cobas x 480 cobas z 480
Mok 等人, ASCO 2013
荧光PCR法检测KRAS突变的位点 最多覆盖21种突变类型
Mutation Freq 34.30% 22.70% 8.90% 6.20% 6.20% 1.30%
Roche:cobas KRAS
Qiagen:theras 源奇 :爱必源 creen KRAS KRAS RGQ
方法
众多方法 – 优点 /缺点
样本
试剂
多种试剂, 质量不一
样本制备时质量和 数量的不确定性 - 肿瘤百分比 - 突变百分比 - 抑制剂
实验室
操作步估
DNA 抽提及质控
EGFR突变检测
ARMS
测序法
其它方法
检测报告
第一代测序
直接测序法，Sanger测序
6254
EURTAC临床研究
使用cobas EGFR检测筛选突变的患者
2012 ASCO（芝加哥 ）大会上，罗氏报告了EURTAC临床研究中入组的患者使用 cobas EGFR检测后的临床结局情况 。
• 采用cobas EGFR检测确认存在突变的患者，与将化疗作为一线治疗的人群相比， 使用特罗凯治疗的人群平均生存期明显延长. (9.7个月 VS 5.4个月 中位数)