MALDI-TOF的样品制备¾样品制备¾基质选择¾样品净化样品制备的一般顺序：选择基质制备基质溶液制备样品溶液混匀基质和样品点靶放干100 pmol/µl多聚物10 -100 pmol/µl 核酸0.1 -10 pmol/µl (糖蛋白10 pmol/µl)多肽和蛋白质理想浓度样品类型理想的样品浓度注: 1 pmol/ul = 10-6M 常见的样品制备方法干燥液滴法真空干燥法压碎结晶法快速蒸发法双层法夹心法电喷雾法快速点样法预点基质法先点样品法 压片法干燥液滴法操作步骤：•在适当的溶剂中配制新鲜的饱和基质溶液•离心,吸取5-10 uL基质溶液上清,加到小离心管中•加入1-2 uL样品溶液(1-100 mM) ，涡旋混匀•吸取0.5-2 uL点靶•室温自然干燥本法最为常用，适用于大多数情况。
干燥液滴法的优缺点优点1.方法简单，适用于很多种样品2.具有较好的耐盐性3.适用于混合物4.可以洗去表面的不挥发性盐份缺点1.使用某些基质（如2,5-dihydroxybenzoic acid ）时，结晶不均匀，容易长在液滴的外环边上。
2.有些组份与基质不能形成共结晶。
真空干燥法操作步骤：•在适当的溶剂中配制新鲜的饱和基质溶液•离心,吸取5-10 uL基质溶液上清,加到小离心管中•加入1-2 uL样品溶液(1-100 mM) ，涡旋混匀•吸取0.5-2 uL点靶•把靶放入真空干燥器内，抽真空到10-2Torr以下，使溶液快速干燥注：本法是干燥液滴法的一种变体。
真空干燥法的优缺点优点减小结晶颗粒的大小提高结晶的均匀程度提高质量准确度和分辨率缺点效果不总是好于干燥液滴法需要额外的真空泵碱金属离子加合峰较强压碎结晶法操作步骤：•在适当的溶剂中配制新鲜的饱和基质溶液•离心,吸1 uL基质溶液点到靶上，自然放干•取一块干净的玻璃片盖在基质晶体上按压•轻轻刷去多余的基质碎颗粒•吸取5-10 uL基质溶液上清,加到小离心管中•加入1-2 uL样品溶液(1-100 mM) ,涡旋混匀•吸取1 uL混合液点到压碎的干燥基质上•室温自然干燥1分钟后，把靶浸入蒸馏水中，以除去不挥发性溶剂•用吸水纸吸去多余水份，自然放干注：本法适用于含有高浓度不挥发性物质（如甘油、尿素、DMSO等）的样品压碎结晶法（简化版）操作步骤：•在适当的溶剂中配制新鲜的饱和基质溶液•离心，吸1 uL基质溶液，用枪头在靶上涂刮，自然放干•吸取5-10 uL基质溶液上清,加到小离心管中•加入1-2 uL样品溶液(1-100 mM) ,涡旋混匀•吸取1 uL混合液点到压碎的干燥基质上•室温自然干燥1分钟后，把靶浸入蒸馏水中，以除去不挥发性溶剂•用吸水纸吸去多余水份，自然放干。
注：本法适用于含有高浓度不挥发性物质（如甘油、尿素、DMSO等）的样品压碎结晶法的优缺点优点1.简单有效2.对高浓度杂质有较好的容耐性3.结晶更均匀，点与点之间的重现性更好缺点1.比较费时2.难以高通量3.吸取基质溶液时，要防止吸入未溶解的基质颗粒快速蒸发法操作步骤：•在丙酮中加入1-2%的水或0.1%TFA(v/v)，再加入基质，使其浓度至半饱和（饱和至1/3饱和之间）•吸0.5 uL基质点靶•吸1 uL样品溶液点在放干的基质颗粒上，放干•除盐：吸5-10 uL0.1% TFA加到样品点上，放置2-10秒钟，吹去液滴注：本法的分辨率和准确度最好快速蒸发法的优缺点优点1.结晶均匀，颗粒小，无甜点效应2.信号强度与浓度的相关性更好3.灵敏度、分辨率和准确度更好4.便于除盐5.可批量预点基质(类似于PAC靶)，便于通量分析缺点1.制样的重现性较差，点与点之间的重现性较差2.对肽有效，但对蛋白的效果久佳双层法操作步骤：•先配底层基质：用易挥发溶剂（如丙酮或甲醇）配制浓的基质溶液(5-50 mg/mL)•吸0.5 uL底层基质点靶，放干•再配上层基质：在适当的溶剂（对基质的溶解能力不能太强太快）中配制新鲜的饱和基质溶液•离心,吸取5-10 uL基质溶液上清,加到小离心管中•加入1-2 uL样品溶液,涡旋混匀•吸取0.5 uL点在放干的基质颗粒上，放干•除盐：吸5-10 uL0.1% TFA加到样品点上，放置2-10秒钟，吹去液滴注：本法结合了压碎晶体法和快速蒸发法的特点，分辨率和准确度很好双层法的特点1.继承了快速蒸发法的优点，克服了其不足2.提高了灵敏度和制样重现性3.对于含有多肽和蛋白质的混合物很有效夹心法操作步骤：•在丙酮中加入1-2%的水或0.1%TFA(v/v)，再加入基质，使其浓度至半饱和（饱和至1/3饱和之间）•吸0.5 uL基质点靶•吸1 uL样品溶液点在放干的基质颗粒上，放干•再配上层基质：在适当的溶剂（对基质的溶解能力不能太强太快）中配制新鲜的饱和基质溶液•吸1 uL上层基质溶液点在放干的样品点上，放干。
夹心法（改良版）操作步骤：•在丙酮中加入3%体积的0.1%TFA，再加入基质至饱和•吸取10 ul该饱和溶液涂在AnchorChip靶的两排点上，立即自然干•吸1 uL样品溶液点在放干的基质颗粒上，放干•再配上层基质：在适当的溶剂（对基质的溶解能力不能太强太快）中配制新鲜的饱和基质溶液•吸1 uL上层基质溶液点在放干的样品点上，放干•加5ul 10mM 柠檬酸氢二铵(含0.1%TFA)以除盐。
放置10秒后吸干•加1 ul重结晶溶液(0.1g HCCA 溶解在1L乙醇:丙酮:0.1%TFA (6:3:1)的混合液中)。
电喷雾法操作步骤：•用毛细管吸取少量配好的样品与基质的混合溶液•把毛细管固定在金属靶板的上方，管尖离靶板0.5–3 cm。
•靶板接地,在毛细管上加3–5 KV的电压，使溶液喷在靶板上。
注：样品分布均匀，结晶颗粒很小很匀。
电喷雾法的优缺点优点1.制样均匀,重现性很好2.信号强度与样品浓度的相关性很好3.样品更耐激光的轰击4.可以与毛细管电泳或液相色谱进行连接缺点1.操作繁琐费时，每个样品约需5分钟，通量较低。
2.容易形成盐的加合物，需要脱盐3.需要额外设备和培训4.需要高电压，有一定危险快速点样法操作步骤：z吸1 uL样品点在靶上z立即再加1 uL基质溶液z用枪头在靶上混匀z风干后,加2-5 uL冷水进行靶上除盐快速点样法的优缺点优点1.快速2.适于蛋白的靶上酶解分析3.便于在样品中加入内标缺点1.条件不易控制2.重现性较差预点基质法操作步骤：•在靶上点好基质,放干备用•把样品溶液点在基质上注: 本法快速,灵敏度高,可以与液相色谱或毛细管电泳相连进行在线点靶先点样品法操作步骤：•先在AC靶上点样品(考染酶解液1ul ，银染酶解液3ul)。
•放干后，再点1 ul基质(0.4mg/ml HCCA溶于70%乙腈，0.1%TFA)。
•放干后，再点1 ul0.1%TFA，放置1分钟，吸干溶液。
注：适用于胶内酶解样品和AnchorChip靶压片法操作步骤：•把样品与基质碾碎后混匀•在靶上压成片状注:本法适用于无法溶解的样品样品制备注意事项样品应可溶于样品与基质的混合溶剂在制样过程中,要小心溶剂挥发引起组成的变化自然放干或风干,不要加热促干基质溶液要现配要尽量避免不挥发性溶剂,如甘油、PEG、Triton-X100、DMSO和DMF等尽量对样品进行除杂纯化必要时应进行样品的靶上脱盐及重结晶在点靶前，避免样品与基质的混合溶液中出现未溶解的基质 晶体生长时，溶液的pH值应小于4在最终点靶的溶液中，样品的终浓度应低于10 uM预先混匀法可以使混合物的分析重现性更好¾样品制备¾基质选择¾样品净化基质选择指南: 根据样品的种类及性质核酸多肽/蛋白质多聚物多糖CHCA/HCCAa-cyano-4-hydroxycinnamic acidHCCA广泛应用于多肽和小蛋白的分析，特别适用于多肽的一级和二级质谱分析，是蛋白质鉴定的首选基质。
用CHCA测蛋白分子量时，容易形成带多个电荷的离子。
基质的重结晶纯化（当基质纯度不够时）•在温乙醇中加入CHCA至溶解饱和•过滤除去不溶物后，加入二倍体积的冷水，4°C 静置24 hr以上。
•过滤，沉淀用冷水清洗后晾干即可CHCA的制样方法干燥液滴法这是金属靶的标准制样方法•基质溶液: HCCA饱和于TA (ACN : 0.1% TFA, 1:2)•样品溶液: 多肽和蛋白在溶液中的浓度为10 fmol/ul-1 pmol/ul.•两溶液等体积混匀后，取0.5 ul点靶。
薄层法•在板上点0.5 ul HCCA (在丙酮中饱和)基质，使成一薄层。
也可以在基质溶液中加入1/5体积的硝基纤维素溶液(20 g/l溶于acetone/2-propanol 1:1) 。
•取0.5 ul酸化的样品溶液(pH<6 !) 点在基质层上（如果pH>6，基质层会被溶解）•放干(如果怕样品氧化，可以进行真空干燥（真空度100 mbar）•用5-10 ul冷0.1% TFA靶上脱盐2-3次Sinapinic acid (SA)3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acidSA适用于很多多肽和蛋白质，尤其是分子量较大的蛋白质(10-150 kDa)，也可用于一些极性多聚物的分析和蛋白质的源内裂解分析，但对小肽(<3 kDa) 的信号较差。
用SA测量蛋白质的分子量时，通常观察到加合离子(+224 Da, 206 Da)SA的制样方法干燥液滴法•把基质SA (饱和于ACN : 0.1 % TFA, 1:2) 和样品溶液等体积混匀•取1 ul点靶，室温自然放干双层法(可提高灵敏度)•把底层基质SA (饱和于乙醇) 点到靶上，使形成一薄层•样品用0.1 % TFA稀释至1 pmol/ul•把样品与上层基质SA溶液(饱和于ACN : 0.1 % TFA, 1:2)等体混匀•取0.5 ul点到底层基质上注：对于MW>50 kDa的蛋白质，可以用上层基质SA溶液(饱和于ACN : 0.1 % TFA, 1:2)稀释样品。
先用干燥液滴法，也可以用压碎晶体法DHBDHB (2,5-dihydroxybenzoic acid, gentisic acid)2,5-DHB广泛应用于多肽、蛋白质、极性多聚物和多糖等的分析，是磷酸肽和糖肽分析常用的基质，也可用于蛋白质的ISD分析和脂类的分析。
适用于AnchorChip™靶，不加有机相在水中即可溶解。
缺点：结晶呈大的针状，不均匀，导致分辨率和准确度下降DHB的制样方法干燥液滴法(用于多肽和蛋白质)•将样品和基质溶液2,5-DHB (10 g/l in ACN : 0.1 % TFA , 1:2) 等体积混匀后点靶•用SDHB 取代2,5-DHB，可减少大蛋白(>50 kDa)的碎裂•用AnchorChip靶可避免甜点效应，并提高灵敏度干燥液滴法(用于多糖)•把样品溶液(10 pmol/ul in water) 和基质溶液2,5-DHB (EtOH:H2O , 1:2) 等体积混匀•取1 ul点靶，凉风吹干•多糖以加钠峰的形式存在于样品点的中央而不是周边的晶体中干燥液滴法(用于PEG)•把样品(5mg/ml)、基质2,5-DHB (10 mg/ml) 和0.1M 三氟乙酸钠(13.6 mg/ml)均溶于丙酮，按体积比10:50:2混匀•取0.5 ul点靶DHB基质的不同干燥方法比较真空干燥•容易形成盐加合物•结晶更均匀,便于自动分析•利于中性多糖和聚合物的分析•效果类似于使用高比例有机相作基质溶剂自然干燥•盐加合物较少•结晶不均匀•利于多肽和蛋白的分析superDHB(sDHB)“Super DHB”(DHB + 10% 5-methoxysalicylic acid)SDHB 是2,5-dihydroxybenzoic acid (2,5-DHB)和2-hydroxy-5-methoxybenzoic acid的混合物，适用于大蛋白和糖蛋白的分析及蛋白质的ISD分析。