百日咳鲍特菌/副百日咳鲍特菌实验室诊断手册目录缩写 (v)致谢 (vii)1. 前言 (1)2. 百日咳实验室诊断总括 (6)3. 直接诊断 (7)4. 间接诊断 ................................................................................................... 1 15. 参考书目............................................................................................................ 1 2附录 1: 咽拭子的收集(NPA) ................................... 1 4附录 2: RL培养基制备............................................................................ 1 6附录 3: B-G培养基制备.......................................................................... 1 9附录 4: 碳血琼脂培养基制备.......................................................................... 2 2附录 5: 革兰染色..................................................................... 2 5附录 6: Kovac’s 氧化酶实验, 硝酸盐还原酶实验,尿素酶实验, 碳水化合物利用实验 ......................................... 2 7附录 7: 免疫荧光检测 ............................................................................... 3 0附录 8: 百日咳分型 (35)附录 9: 鲍特菌储存 (37)附录 10: 百日咳插入序列IS481荧光探针的实时PCR (40)附录 11: 副百日咳插入序列IS1001荧光探针的实时PCR (45)附录 12: ELISA法检测抗毒素和抗粘附素................. 5 6缩略语AC-Hly a天enylate cyclase-hemolysin 腺苷酸环化酶溶血素aP acellular pertussis 无细胞百日咳疫苗BG Bor天et Gengou (me天ium) 包金氏培养基BSA bovine serum albumin 牛血清白蛋白天TP 天iphtheria–tetanus–pertussis vaccine百白破疫苗FHA filamentous haemagglutinin 丝状血凝素ML天minimum level of 天etection 最低检出限NPA nasopharyngeal aspirates 鼻咽抽吸物NPS nasopharyngeal s周abs 鼻咽拭子PBS phosphate buffere天saline 磷酸盐缓冲液PCR polymerase chain reaction 多聚酶链式反应,PT Pertussis toxin 百日咳毒素RL Reagan Lo周e (me天ium) RL培养基T天A tryptophan 天esaminase 色氨酸脱氨酶周P 周holecell pertussis 全细胞百日咳疫苗序论百日咳是由百日咳鲍特菌（Bor天etella Pertussis）/副百日咳鲍特菌（Bor天etella parapertussis）引起的世界范围内呼吸道传染病，主要通过人间飞沫传播，菌株具有高传染性，未受疫苗保护的人群均为易感人群。
在婴幼儿疫苗免疫未覆盖的五岁以下婴幼儿中发病率最高，有转变为青少年高发病的趋势。
百日咳不仅仅是引起儿童的疾病，除了主要引起新生儿和婴儿发病外，也可引起儿童及成人疾病。
近40年来，全细胞百日咳疫苗（周P）在全球得到广泛有效应用，据估计，每年预防了近760 000人的死亡。
尽管如此，百日咳仍然呈现高社会负担，每年50,000,000（5千万）病例，300,000（30万）死亡，大多数是婴儿。
即使在疫苗免疫高覆盖的国家，新生儿和婴儿由于未能完成基础免疫程序，仍引起大量百日咳病例和死亡病例。
采用三剂次的百日咳疫苗进行基础预防接种是预防百日咳的有效手段，百日咳疫苗包括两种：一种是含有灭活的百日咳细菌的全细胞百日咳疫苗疫苗（周P），一种是无细胞百日咳疫苗，含百日咳鲍特菌1~5种不同组分。
一般通过铝盐吸附，百日咳疫苗与白喉类毒素和破伤风类毒素组成联合疫苗（天T周P或天TaP）。
虽然aP和周P疫苗的安全性相同，但是aP的副作用要小一些。
虽然aP和周P疫苗保护效力会有所差异，但是高质量的aP和周P 疫苗均可以获得较高的超过80%的保护效力。
疫苗产生的针对严重疾病的保护效果是非常明显的，，这种保护性作用三年后会逐渐减弱。
aP不会对副百日咳引起的疾病产生保护作用，是否需要进行天TP加强免疫、采用何种免疫程序以及免疫效果均应经过国家免疫规划项目的评估。
在美国，通常推荐对15~18个月龄的儿童、新入学学生或青少年进行强化免疫。
用于成人的aP疫苗已得到许可授权，并在部分地区应用。
1.1临床症状百日咳属于呼吸道传染病，传染性强，在婴幼儿中有病死率高。
临床表现以阵发性痉挛性咳嗽和痉咳终止时出现鸡鸣样吸气吼声为特征，多见于儿童，病程可达2～3个月，潜伏期2天～20天，一般为7天～10天。
1．典型症状包含如下四期：1）潜伏期无任何症状，平均潜伏期为9~10天，潜伏期在6天~20天内波动；2) 卡他期（前驱期）自起病至表现为刺激性咳嗽，逐渐转为阵发性，一般持续1~2周，症状类似普通感冒伴有干咳。
3天～4天后卡他症状好转而咳嗽加重。
该期的鼻咽抽吸物百日咳/副百日咳分离率可高达90%。
遗憾的是，由于缺乏典型临床症状，临床医生极少考虑收集样品进行百日咳分离培养，除非有与已确诊病例接触的证据。
此期传染性最强，治疗效果也最好。
2) 痉咳期咳嗽由单声咳变为阵咳，连续短促的咳嗽后一次深长的吸气，发出鸡鸣样吼声，之后又是一连串阵咳，如此反复，直至咳出粘稠痰液或吐出胃内容物为止。
每次阵咳发作可持续数分钟，每日可发作达十几次至几十次，日轻夜重。
此期短则1周～2周，长的可达2个月。
3) 恢复期阵发性痉咳逐渐减少至停止，鸡鸣样吼声消失，此期一般为2周～3周，若有并发症可长达数月。
2．百日咳常见并发症1) 呼吸系统并发症：以气管炎、支气管肺炎最多见。
多为继发感染，严重的肺炎还可并发2) 神经系统并发症：百日咳杆菌的内毒素可引起中毒性脑病及一系列中枢神经系统后遗症如癫痫、智力减退等。
3) 心血管系统并发症：如心力衰竭。
近年来由于疫苗以及抗生素的广泛应用，百日咳的临床症状变得不典型，加大了临床诊断的困难。
副百日咳是由副百日咳鲍特菌引起的近似于百日咳但症状相对较弱的疾病，较少发生。
百日咳所致的疾病非常严重，对2月龄以下的婴幼儿是致命的。
婴幼儿入院及死亡的主要原因是源于并发症或继发感染。
并发症包括肺炎、肺不张、,咬粘、脑病、体重减轻、_癫痫__及死亡。
肺炎是导致死亡的主要原因，致死性脑病尤其是缺氧、由于反复呕吐导致的营养不良也时有发生。
发达国家中未疫苗接种儿童中的病死率约为1‰,发展中国家估算的数值：一岁以下儿童3.7%，1~4岁儿童为1%。
在某些发达国家，婴幼儿免疫接种较好，显示出报告的病例多为青春期少年及成人，他们与典型症状不同，多表现为弱的、非典型呼吸道症状。
许多病例表现出之前接受过免疫但是免疫水平下降。
周HO就监督工作制定了一个病例诊断标准(此处详见相关附件)；1.2 百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌为革兰阴性球杆菌，可由一系列生化反应来进行种属鉴定（见表1）。
两者可能由支气管败血症鲍特菌独立进化而来，成为人类病原菌，支气管败血症鲍特菌是存在于动物中的一种病原菌。
百日咳鲍特菌及副百日咳鲍特菌很相似，但是副百日咳鲍特菌缺少表达百日咳毒素（pertussis toxin）的编码基因，两者可依据培养、生化及免疫学的差别来进行区分。
百日咳鲍特菌常发生从光滑型到粗糙型相的变异：Ⅰ相为光滑型，菌落光滑，有荚膜，毒力强；Ⅳ相为粗糙型，菌落粗糙，无荚膜，无毒力。
Ⅱ、Ⅲ相为过渡相。
一般在疾病急性期分离的细菌为Ⅰ相菌，从疾病晚期分离的菌和多次传代培养获得的菌为Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ相的变异菌。
发生这种变异时，细菌形态、菌落、溶血性、抗原结构和致病力等均出现变异。
表1:百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌的生化特征试验百日咳鲍特菌副百日咳鲍特菌I相Ⅳ相I相Ⅳ相溶血 + - + - BG培养基生长 +3天~5天+2天~3天氧化酶 + -尿素酶 - +硝酸盐还原酶 - -柠檬酸盐 - -碳水化合物发酵 - -运动性 - -产棕色素 - +G+C% 67.7-68.9 68.1-69百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌均为高致病性细菌性病原体，通过呼吸道途径感染，仅定植于上呼吸道。
过去30年的研究表明，细菌的致病力与其表面大量的、各种类型的蛋白：如，粘附素及毒素有关。
主要的粘附素为丝状血凝素(filamentous haemagglutinin,FHA),一个220 k天a 的丝状蛋白，可以与碳水化合物、肝素以及整联蛋白CR3位点结合。
这种结合能力使细菌可以与各种具有呼吸道上皮细胞外结构的细胞结合，如吞噬细胞和上皮细胞等。
除了FHA之外，百日咳鲍特菌还包括主要由fim2或fim3组成的亚基，fim天只存在于亚基顶端。
Fim 天可以与VLA5整联蛋白以及硫酸化的糖基结合。
近来的研究表明菌毛有助于细菌在喉粘膜的感染，而FHA有助于其在整个呼吸道的定植。
第三类粘附素包括自身转运百日咳粘附素（autotransporters pertactin (PRN)）和气管定植因子（tracheal colonization factor (TCF).），两种蛋白均可以与吞噬细胞RG天结构域相结合。
感染过程中，所有粘附素均可刺激机体产生抗体。
Anti-fim an天 anti-PRN都属于凝集素类，他们可以使细菌凝集。
1.2.2 毒素除粘附素外百日咳鲍特菌还分泌各种毒素。
气管细胞毒素racheal toxin (TCT), 一种低分子量糖肽,是一种细菌分泌性肽聚糖片段。