*广西自然科学基金资助项目(桂科自9912038)1第一附属医院药剂科收稿日期:2003-05-10玉郎伞提取物对超氧阴离子自由基和羟自由基的抑制和清除作用*焦 杨 段小群 黄仁彬 韦锦斌 蒋伟哲1(广西医科大学药理学教研室 南宁 530021)摘要 目的:探讨玉郎伞提取物(Y LS)对氧自由基的抑制和清除作用。
方法:采用分光光度法检测Y L S 对超氧阴离子自由基(O 2·-)和羟自由基(·O H )的清除及抑制作用。
结果:Y L S 浓度为0.15、0.30、0.60g /ml 在体外对·O H 的清除率分别为7.1%、29.1%、68.5%,对O 2·-的清除率分别为40.5%、49.9%和64.5%,对O 2·-生成的抑制率分别为48.0%、60.3%和68.8%。
结论:Y LS 对O 2·-具有明显的抑制及清除作用,对·O H 也有一定的清除作用。
关键词 玉郎伞提取物;超氧阴离子自由基;羟自由基;清除作用中国图书资料分类法分类号 R285.5SCAVENGING AND I NHIBITIING EFFECT OF YULA NGS AN EXTRACT ON SUPEROXI -DE ANION FREE RADICAL AND HYDROXY FREE RADICALJ iao Yang ,Duan Xiaoqun,Huang Renbin,et al.(Depa rtm ent of Pha rmaco logy ,Guang xi Medical Univ ersi-ty ,Nanning 530021China )Abstract Objective:To study the scavenging effect o f YU LANGSAN ex tract on supero xide anio n free radical (O 2·-)and hydrox y free radical (·O H ).Methods :Spectro photometry (w av e leng th 322nm a nd 536nm )w as used to observ e the effects o f YLS o n O 2·-and ·O H .Result :The lev el of ·O H was reduced by 7.1%,29.1%,68.5%in the presence o f YLS 0.15,0.30,0.60g ·ml -1,the lev el of O 2·-w as reduced by 40.5%,49.9%and 64.5%,respectively .The genera tion o f O 2·-w as inhibited by 48.0%,60.3%a nd 68.8%,respectiv ely ,in the presence of YLS 0.15,0.30,0.60g ·ml -1in v itro .Conclusion :The results show that YLS can g rea tly scav eng e O 2·-(P <0.01)and ·O H,and inhibit the productio n of O 2·-.Key words YU LANGSAN ex tract;superoxide a nion free radical;hydrox y free radical;scav enging effect 玉郎伞是一种尚未开发利用的民间草药,为蝶形花科植物疏叶崖豆M illettia pulchra Kur z va r .lax io r (Dunn )Z .W ei 的块根,具有舒筋活络、补虚润肺之功能,民间用于腰腿痛、风湿痛、慢性肝炎、肺结核等的治疗[1]。
本研究小组的一些药理学研究初步表明,玉郎伞提取物(Y L S )具有降低血压、减轻心肌缺血再灌注损伤、减轻急性化学性肝损伤等作用[2]。
本研究探讨其在体外对连苯三酚氧自由化产生的氧自由基(O 2·-)和由邻二氮菲-Fe 2+/H 2O 2体系产生的羟自由基(·O H)的抑制和清除作用。
1 材料和方法1.1 材料:Y L S 由本室自行提取,每毫升溶液含生药3g 。
连苯三酚为中国医药(集团)上海化学试剂公司生产,批号为F010630;邻二氮菲、硫酸亚铁为上海试剂三厂生产,均为分析纯。
1.2 仪器:分光光度计(DU -640,美国Beckman 公司)。
1.3 方法[3,4]:1.3.1 ·O H 的生成及清除率的测定:配制含邻二氮菲0.75mmo l /L 、Fe SO 40.75mmol /L 磷酸盐缓冲液(pH 7.3)150mmol /L 的溶液作为反应体系,加0.01%H 2O 2(损害)或不加H 2O 2(未损害),37℃保温60min 后,以磷酸盐缓冲液为参比,分别测536nm 时的吸收值,得A 损害与A 未损害。
上述反应体系加入0.01%H 2O 2和一定量的Y L S,以同浓度Y L S 作参比,测536nm 时的吸收值,即得A 样。
重复8次。
按下式计算·O H 清除率:·O H 清除率(S %)=(A 样-A 损害)/(A 未损害-A 损害)×100%。
1.3.2 O 2·-的生成及清除率的测定:配制含磷酸盐缓冲液(pH8.3)50mmo l /L 、连苯三酚0.2mmo l /L 的溶液作为反应体系,反应温度为25℃,测定波长为322nm 。
此反应体系中加入一定量Y L S,以同浓度Y L S 作参比,测定反应启动后10s 时的吸收值(A 样)。
另取试剂同上,不加Y L S,作为空白对照,以PBS 为参比,测反应启动后10s 时的吸收值(A 空)。
重复8次。
按下式计算清除率:O 2·-清除率(S %)=(A 空-A 样)/A 空×100%。
·22·广西医科大学学报J OU RNAL O F GUANGXI M EDICAL UN IV ERS ITY 2004Feb ;21(1)DOI:10.16190/ k i .45-1211/r.2004.01.0101.3.3 O2·-生成的抑制率测定:反应体系同上。
反应启动后每30s测一相应吸收值,至4.5min止。
将所得吸收值与时间(min)进行回归分析,其斜率为O2·-生成速度(V)。
V空白为以磷酸盐缓冲液(p H8.3)为参比,加入连苯三酚启动反应后测得的O2·-生成速度;以Y L S为参比,反应体系中加入一定量的YL S,加入连苯三酚启动反应后测得的O2·-生成速度为V样。
重复8次。
按下式计算抑制率:O2·-抑制率(I%) =(V空白-V样)/V空白×100%。
1.4 统计学处理:所有数据以x-±s表示,采用EX CEL统计软件以t检验和线性回归进行统计学处理。
2 结 果2.1 对·O H和O2·-的清除作用:在本试验条件下,Y L S 对·O H和O2·-具有明显的清除作用(P<0.01或P< 0.05),见表1、表2。
表1 Y LS对·O H的清除作用(x-±s,n=8) 组别 吸收值(A)·O H清除率(%)损害组0.2459±0.0078未损害组0.7122±0.0387**Y LS0.15g/ml0.2791±0.0032*7.1 Y LS0.30g/ml0.3814±0.0040*29.1 Y LS0.60g/ml0.5651±0.0114**68.5维生素C600μmo l/ ml 0.5450±0.0205**64.1 注:与损害组比较,*P<0.05,**P<0.01表2 Y LS对O2·-的清除作用(x-±s,n=8) 组别吸收值(A)O2·-清除率(%)空白对照组0.533±0.009Y LS0.15g/ml0.317±0.015*40.5Y LS0.30g/ml0.267±0.014*49.9Y LS0.60g/ml0.189±0.051*64.5维生素C600μmol/l0.208±0.031*61.0 注:与空白对照组比较,*P<0.01表3 Y LS对O2·-生成的抑制作用(x-±s,n=8) 组别V(A/min)O2·-抑制率(%)空白对照组0.2327±0.0001Y LS0.15g/ml0.1209±0.0110*48.0Y LS0.30g/ml0.0924±0.0001*60.3Y LS0.60g/ml0.0726±0.0013*68.8维生素C600μmol/L0.0795±0.0021*65.8 注:与空白对照组比较,*P<0.012.2 对O2·-生成的抑制作用:用动态方法测得反应的初速率V(A/min)。
速率方程的相关系数r均在0.9990～0.9997之间。
加入YL S后,O2·-生成速率V显著减小(P<0.01),见表3,表3表明Y L S能抑制O2·-的生成。
3 讨 论氧自由基(O F R)主要指O2·-和·O H,由于其可引起细胞损伤和死亡,与某些疾病的发生有密切关系,因此引起广泛的关注。
O F R对机体的影响有两重性,一方面,能够调节花生四烯酸的代谢,刺激吞噬细胞和中性粒细胞的吞噬杀菌功能和免疫过程,有利于机体健康;另一方面,O F R可使许多生物大分子如核酸,蛋白,膜多聚不饱和脂肪酸发生超氧化反应,使生物大分子出现交联或断裂,引起细胞结构和功能的破坏[5,6]。
我们采用体外实验的方法研究Y L S对O FR的影响。
通过Fento n反应,H2O2产生·O H,邻二氮菲-Fe2+被·O H 氧化为邻二氮菲-Fe3+,其536nm处吸收峰消失,因此,测定此处吸收值的变化可以间接得知·O H的变化情况。