核酸分析技术
核酸 基于形态
不基于形态
DNA FISH / DISH / CISH PCR / qPCR / dPCR / 测序 / NGS / aCGH
RNA RNAscope
RT-PCR / 芯片 / NanoString
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基因突变检测
1
11/13/2016
基因突变检测的关键步骤
切片：4-5um
• 预测EGFR TKI等分子靶向药疗效（肺癌） • 预测EGFR单抗（爱必妥）靶向药疗效（结直肠癌） • 评估预后，以及良恶性的鉴别诊断（甲状腺癌） • 预测靶向药Vemurafenib疗效（恶性黑色素瘤）
癌治疗前（病理诊断的同时）
所有国内外肿瘤相关诊疗指南 • 中国晚期原发性肺癌诊治专家共识(2016版) • 结直肠癌诊疗规范（2015年版） • 中国黑色素瘤诊治指南（2010年版）
诊断、预后评估、疗效预测
3
Virchows Arch (2013) 462:27–37
癌基因组的主要改变
点突变
甘氨酸
精 半胱
丝
天冬 丙
Val 缬
拷贝数改变 扩增
缺失
异位
TS, tumor suppressor CML, chronic myelogenous leukemia
Macconaill LE, Garraway LA. Clinical implications of the cancer genome. Journal of Clinical Oncology, 28(35), 5219-5228 (2010).
• 疑难病例, 为明确明确GIST的诊断 • 术前拟用分子靶向治疗 • 所有初次诊断的复发和转移性GIST，拟行分子靶向治疗 • 原发可切除GIST手术后，中至高度复发风险，拟行伊马替尼辅助治疗 • 鉴别NFl型GIST、完全性或不完全性Carney’s三联征、家族性GIST以及儿童GIST • 鉴别同时性和异时性多原发GIST • 继发性耐药需要重新检测
推荐用QIAGEN或同类试剂盒提取DNA 紫外分光光度计：适合新鲜组织DNA质控
测定总量（OD260）及DNA纯度 （OD260/280）
qPCR：FFPE来源DNA的最可靠质控方法 检测可扩增的DNA片断 评估是否存在PCR抑制剂
PCR 产物长度
可扩增DNA
DNA 10倍稀释后
EGFR
1 用途
2 检测时机 3 依据
1 用途
KRAS 2 检测时机
3 依据
1 用途
BRAF 2 检测时机
3 依据
1 用途
c-kit PDGFR
2
3
检测时机 依据
预测EGFR TKIs类靶向药疗效 （易瑞沙、特罗凯、凯美纳等）
肺癌治疗前（病理诊断的同时）
所有国内外肺癌诊疗指南 • 中国原发性肺癌诊疗规范(2016版) • 中国晚期原发性肺癌诊治专家共识(2016版)
2
3. 突变检测的方法
检测已知的突变
不同方法学的比较
检测技术
Sanger测序法 PCR基因扩增→qPCR ARMS、PNA-LNA clamp等
TaqMan-PCR 基因芯片 HRM-PCR
焦磷酸测序 焦磷酸测序/COLD-PCR
灵敏度
20% >20%
1% 10% 10% <1% 5% <0.5%
•支气管下活检
•
•经皮穿刺活检
• 标本处理及贮存
•新鲜冻存：液氮或-80C
建议最少切片数： --手术标本，5 µm X4 --小活检标本，5 µm X8
• 肿瘤细胞总数（>200个） • 标识肿瘤丰富的区域富集肿
瘤细胞
•FFPE
Cancer Challenge: tumor Heterogeneity
肿瘤的异质性------形态学评估十分重要
Intertumour Heterogeneity
Intratumour Heterogeneity ETV1/ERG in Prostate Cancer
实体肿瘤基因突变特点
• 肿瘤组织与其它组织混杂 • 肿瘤异质性，即不是所有细胞都一样
基因突变检测面对100-10000倍的野生模板干扰 • 标本处理的特殊性：福尔马林固定
预测EGFR TKIs或EGFR单抗等分子靶向药疗效 • EGFR TKIs: 易瑞沙、特罗凯、凯美纳等（肺癌） • EGFR 单抗：爱必妥（结直肠癌）
癌治疗前（病理诊断的同时）
所有国内外相关肿瘤诊疗指南（肺癌/结直肠癌） • 中国晚期原发性肺癌诊治专家共识(2016版) • 结直肠癌诊疗规范（2010年版/2015年版）
病理诊断的同时（为明确诊断）
所有国内外肿瘤相关诊疗指南
• 中国胃肠间质瘤诊断治疗共识(201 3年版)
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11/13/2016
1
2
3
4
5 6
Exon18：G719X
7
G719
8
Exon20：S768I
9
TKI敏感突变 TKI耐药突变
2015年
2016年
PCR/测序
EGFR / KRAS / BRAF / CKIT / PDGFR
11/13/2016
分子检测技术在病理诊断中的应用
北京协和医院 曾瑄
分子病理
测序/ NGS
RT-PCR
IHC
ARMS
In situ mRNA Hybridization
FISH
形态病理
基因突变 基因融合 基因拷贝数（基因扩增） 蛋白表达 mRNA表达
分子病理的定义： 分析组织或细胞标本中的核酸，是日常诊断病理之整体工作的一部分。 在肿瘤中, 它用于确定肿瘤的特征或分类, 检测与预后相关的特异性分子 改变, 或明确预测疗效或其它治疗措施的靶标。
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11/13/2016
血液检测
PTMC: 甲状腺微小乳头状癌
• 组织学确认：癌类型、癌细胞数 • 划定癌区域 • 镜下显微切割癌组织
脱蜡 / DNA提取
HE染色
NGS(高通量)
Scorpins-ARMS
结果判读
1. 标本要求
肿瘤组织标本
组织切片
病理学评估
• 组织标本来源
• H&E 染色片用于病理评估 • 肿瘤诊断及组织学类型
•手术标本
• 白片用于提取DNA
• 肿瘤细胞比例（>50%）
方法：选择性（特异性）、灵敏度、实用性
肿瘤异质性
与其它细胞混杂
2. DNA的提取及质量
FFPE标本的特点
不做固定
组 织 样 本
福尔马林固定
长时间福尔马林固定
交联 核酸 蛋白质
纯 化 产 物
纯化核酸并进行 扩增比较简单
纯化核酸并进行 扩增有一定挑战
纯化核酸并进行 扩增比较困难
福尔马林固定时间越长，发生交联的程度越高