中央民族大学生命与环境科学学院生物化学综合性设计实验报告2012年12月一种简便快捷提取小白鼠肝脏DNA 的方法 One a simple and convenient Methods of Genome DNA Extraction ofmouse一种简便快捷提取小白鼠肝脏DNA的方法吕梦春中央民族大学生命与环境科学学院北京100081）摘要: 主要运用了盐洗法提取小白鼠肝脏的基因组DNA, 利用分光光度计测定其OD260与OD280的吸光值,计算比率估计核酸的纯度, 并利用琼脂糖凝胶电泳观察DNA片段在凝胶中的位置, 鉴定DNA.实验结果显示，用盐析法提取的DNA纯度较高。
是一种简单高效的提取动物肝脏的方法。
关键词:小白鼠;DNA提取; 琼脂糖凝胶电泳One a simple and convenient Methods ofGenome DNA Extraction of mouseMeng-chun Lv（MINZU university of china,BEIJING,100081）Abstract：The genome DNAs of mouse were extracted with . Then the ration of OD260 andOD280 was determined by ultraviolet spectrophotometer. The purity of the nucleic acid was calculated and the position of DNA segments in the gel was observed by agar sugar gel electrophoresis Finally, the methods was showed a simple, convenient, swift and economic method to genome DNA extraction.Keywords: mouse; genome DNAs; agar sugar gel electrophoresis;1.前言20世纪50年代初, DNA被证明是所有生物最主要的遗传物质. 随着生物化学、分子生物学和遗传学的发展以及基因工程等生物技术的创立,有关DNA的实验技术也得到了飞速发展. 无论是基因工程, 还是蛋白质工程, 首先都需要从生物体中提取基因组DNA( genomic DNA), 所以DNA的分离提取在分子生物学以及相关学科的研究中是一个非常重要的步骤, 分离得到DNA样品质量的好坏直接关系到下一步实验的成败. 而基因组DNA提取和纯化方法的灵敏度、特异性直接影响DNA的质量. 因此, 许多学者一直在努力探索各种基因组DNA 的提取方法. 目前, 国内外已有多种提取DNA的方法, 如水煮法、酚抽提法、甲酰胺解聚法、盐酸胍裂解法、盐析法等. 在众多方法中,虽然有人对其进行过比较, 但究竟哪一种方法更适用于普遍意义上的DNA提取, 还未见报道. 本实验采用常用的盐洗法对小白鼠肝脏基因组DNA进行提取,是一种简便、快捷、实用的基因组DNA提取方法.1.1实验目的学习从生物中分离DNA（盐析法）的原理和方法；掌握测定核酸DNA的原理和方法；掌握核酸DNA的琼脂糖电泳的原理和方法；1.2实验原理1.2.1关于基因组DNA不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。
在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。
尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。
本次试验中，主要利用不同浓度的NaCl 溶液, 将DNP和RNP从样品中抽提出来. 将抽提得到的核蛋白用SDS处理, DNA即与蛋白质分开. 可用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去,而DNA则溶解在溶液中. 向溶液中加入适量的乙醇, DNA即析出. 为了防止DNA酶解, 提取时加入EDTA( 乙二胺四乙酸) 抑制DNase.加入了RNA酶，分解RNA。
1.2.2关于DNA纯度测定紫外吸收是是实验室中最常用的测定DNA或RNA的方法，核酸样品的纯度可用紫外分光光度法进行测定、读出260nm与280nm的吸光度（A）即光密度（OD）值，从A260/A280的比值即可判断样品的纯度。
纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯的RNA应达到2.0.样品中如含有杂蛋白及苯酚，A260/A280比值即明显降低。
不纯的样品不能用紫外吸收法做定量测定。
对于纯的样品，只要读出260nm的A值即可算出其含量。
通常以A值为1相当于50μg/ml双螺旋DNA,或40μg/ml单链DNA（或RNA），或20μg/ml寡核苷酸计算。
这个方法既快速又相当准确，而且不会浪费样品。
对于不纯的核酸可以用琼脂糖凝胶电泳分理处区带后，经溴化乙锭染色在紫外灯下粗略地估计其含量。
1.2.3关于琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。
但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。
蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。
电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。
常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚苯烯酰胺低，但它制备容易，分离范围广。
普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
我们需注意：1）准备干净的配胶板和电泳槽注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象2）选择电泳方法一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。
注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。
3）正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。
低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。
注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
4）适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。
电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。
注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
5）电泳的合适电压和温度电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15℃。
注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA 带迁移的现象。
特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象6）DNA样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。
乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。
注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。
在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。
7）DNA的上样正确的DNA上样量是条带清晰的保证。
注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。
TIANGEN公司DNA分子量标准每次上样6ul 即可得到清晰均匀的条带。
8）Marker的选择DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。
Marker 应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。
TIANGEN公司的DNA Marker条带清晰，亮度均匀，质量稳定，是您实验的首选。
需要注意的是Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。
如果选择λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65℃加热5min，冰上冷却后使用。
从而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。
9）凝胶的染色和观察实验室常用的核酸染色剂是溴化乙锭（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。
而其他系列例如SYBR Green，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。
TIANGEN 公司的GeneGreen相比则是性价比高的低毒替代染料，其灵敏度比传统EB染料高10倍以上。
注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。
2实验材料2.1材料：0.2g 小白鼠的新鲜肝脏2.2仪器：移液器（10uL，20uL，50 uL,100uL, 500uL,1000uL各一支），分析天平，剪刀，台式高速离心机，玻璃棒，恒温水浴锅，动物组织匀浆机，离心管（有盖，10mL，5mL，各五支），量筒（50mL一个），三角瓶（250mL）胶头滴管，电泳仪等2.3试剂：1）0.14mol/L NaCl-0.15mol/ L EDTA溶液：2.045g NaCl+9.300gEDTA二钠盐，定容到250mL,调PH到8.0；2）25% SDS溶液：6.25g十二烷基硫酸钠+25mL25%乙醇；3）5 mol/L NaCl 溶液：7.308gNaCl定容到25mL；4）1.5mol/ L NaCl-0.15mol/ L柠檬酸三钠溶液：2.07g NaCl+0.853g柠檬酸三钠,定容到25mL；5）0.015mol/ L NaCl-0.0015mol/ L柠檬酸三钠溶液：0.5 mL1.5mol/ L NaCl-0.15mol/ L柠檬酸三钠溶液,定容到50mL；6）氯仿-异戊醇混合液：48mL氯仿+2mL异戊醇；7）乙醇：70%, 80%,95%，无水乙醇各25mL；8）0.5xTBE缓冲液：5.4gTris碱+2.75g硼酸+2 mL0.5 molEDTA-Na (0.372gEDTA 二钠盐定容到20mL),定容到1L，调PH到8.0。