・专论・关于中药活性成分的认识及其研究方法王本祥1,周秋丽2(11长春中医学院新药研究中心,吉林长春　130021;21白求恩医科大学医学生物工程研究所,吉林长春130021) 什么是中药有效成分的问题,至今大家在认识上仍有很大的不同,致使各自所采用的研究方法亦有所不同,最终导致彼此所开发药物的质量标准和药效都有很大差异。

目前,我国中成药的质量标准与发达国家的药品质量标准有较大差距,致使我国的中成药很难进入发达国家的药品主流市场。

为早日改变我国中成药在国际药品市场上的不利地位,我国中药研究工作者必须对中药的有效成分有一个科学的认识,然后确立一种科学的研究、分析和制备中药有效成分的方法,使我国中成药的质量标准符合发达国家的药品质量标准。

本着百家争鸣和百花齐放的精神,就有关中药有效成分的概念、来源及分析有效成分的化学结构及生物活性等几个重要问题与同道们商榷,以期求得共识和达到加速中药现代化的目的。

1　何谓中药有效成分至今,关于什么是中药有效成分的认识很不一致。

有人提出中药介于药物和食品之间的论点,认为中药材中所有化学成分都是有效成分(简称全成分论)[1]。

当然我们的认识与这种观点差异较大,否则就不会探讨和分析中药有效成分的问题了。

近10年来,在报章杂志和学术会议上经常有人提出中药复方的作用为多成分和多靶点综合效应的观点(简称多成分论)[1]。

提出这种论点的学者们的论据很简单,他们说因为中药复方由多味中药组成,如果一味中药含十几种乃至几十种成分,那么一个复方就可能含几十种乃至上百种成分,所以一个中药复方的作用是几十种乃至上百种成分的综合效应。

这样看来研究中药复方的有效成分谈何容易,这也是至今人们对中药复方有效成分研究望而却步的主要原因。

其实“全成分论”和“多成分论”[收稿日期]　1999210221的认识本质是相同的,即他们都把中药材中的化学成分看成为有效成分。

对上述‘全成分论’和‘多成分论’的观点,我们持谨慎和保留态度。

这是因为,唯物辩证法认为,如果是存在着两个以上矛盾的复杂过程的话,就要用全力找出它的主要矛盾,捉住了这个主要矛盾,一切问题就迎刃而解了。

疾病和治疗疾病的药物是矛盾是对立统一体的两个方面,例如治疗高血压症的中药复方,因为血压升高是该过程的主要矛盾,所以中药复方中降血压成分应视为解决主要矛盾的主要有效成分;而其它,如镇静和利尿等有助于高血压治疗和康复的成分应视为解决主要矛盾的次要有效成分。

所以解决这一问题的关键在于能否找到该复方降血压以及镇静、利尿有效成分。

我们认为任何一个较好的和符合中医组方原则的中药复方中,君药经常为一种,其中主要有效成分不会很多,可能只有一种或几种化合物。

而臣药或佐使药中的次要有效成分可能几种或更多些,诸种次要成分对主要有效成分的药理作用起到作用协同、相加、拮抗影响,最后表现的综合效应,就是该复方的药理作用。

而那些具有其它生物活性的化学成分则不能视为本复方特定药理作用的有效成分,当然,在中成药或水煎剂中,不能被吸收和无复方特定药理作用的许多化学成分都不能视为有效成分。

如此看来,在一个治疗高血压的中药复方中,降压和辅助降压的镇静、利尿成分为该复方的有效成分,这样的成分不会很多,几种乃至更多些。

另外,吸收入血的某些成分,经过富集和提纯后需要加大到高于其原来在血清中的浓度许多倍时,才具有与本复方相关的药理作用,这样的化学成分也不应视为本复方的有效成分。

所以当用高灵敏度的检测技术,如高效液相色谱仪(HPLC)和电喷雾质谱仪(ESI—MS)确定吸收入血的化学成分时,不能就认为它们检测出的化学成分都是有效成分,应・1・该说它们当中有一部分可能是有效成分。

而那些低于最小有效量或有效浓度的吸收入血化合物,依我们的观点它们也不一定是该复方的有效成分。

如果以上述观点审视和研究中药复方的话,我们有可能研究和开发出药味更少和疗效更高的新药。

综上所述,我们认为中药复方的药效为其主要有效成分与次要有效成分的综合效应。

我们的观点与“全成分论”和“多成分论”的区别,在于我们认为中药复方的有效成分不是很多,而是有限和较少的。

2　中药复方有效成分的来源临床上的各种口服中成药,其吸收入血产生药效的有效成分大致有以下4个来源:①药材固有的化学成分;②加工炮制和煎煮过程的产物;③肠内菌代谢产物;④吸收入血进入肝脏经“首过效应”的代谢产物。

上述认识已经为大量的研究报道所证实。

目前大多数从事中药化学的研究者,对中药有效成分的第①和②两种来源比较熟悉,而对第③和④两种来源知之不多,否则就不会出现毫无根据的将口服制剂直接改革成中药注射剂的做法。

日本学者[2～4]和我们[5,6]的研究已经证明,中药苷类成分(如甾体皂苷和黄酮苷类化合物)在口服后都要被肠内菌代谢成新的代谢物,某些肠内菌代谢物是其真正的有效成分,有些化合物经门静脉吸收进入肝脏后,又可被肝脏代谢成新化合物[7]。

可见,原药材中的化合物乃是前体药物。

3　研究中药有效成分的切入点要想阐明一个复方在体内究竟是何种化学成分起到治疗作用及其作用机制,并非简单和容易解决的事情。

以前人们称其为理不出头绪的一团乱麻,或称其为难以琢磨的“黑匣子”。

如何打开这个“黑匣子”乃是我们药学工作者为之奋斗多年和梦寐以求的事情。

因为如果能破译这个“黑匣子”,我们将从中获得许多宝贵的信息,如可能开发出中药复方一类新药、可能发现许多有活性的先导化合物、可能从分子水平揭示复方的作用机制和各有效成分的相互配伍关系等等。

现在首要问题是先要确定“黑匣子”的位置和打开它的途径。

我们认为中药活性成分的“黑匣子”在血清中。

因为只有血清是上述4种来源的活性成分共存的唯一位置。

无论是药材中的固有成分、煎煮过程产生的成分或经肠内菌和肝脏代谢产生的成分,绝大部分有效成分(除了治疗胃肠道内疾病,如肠炎和胃溃疡外)都要在吸收入血后才能产生治疗作用。

因此应该把服药动物或人的血清做为研究和分析中药有效成分主要对象。

在国家自然科学基金会和国家中医药管理局的资助下,我们相继研究了大鼠和人口服单体化合物人参皂苷Rb1[5,6]、Rg1[7,8]、淫羊藿苷[9]、氧化苦参碱及有效部分黄山药总苷和人参二醇组皂苷以及中药复方(芍药甘草汤和参附汤)肠内菌代谢物和吸收入血成分的化学结构和生物活性。

不难看出我们的上述研究工作是由简单到复杂,除芍药甘草汤和参附汤的研究仍在进行外,其它研究已陆续完成。

总的看来,在我们确立的前述中药有效成分概念的前提下,对HPLC和ESI2MS检测的吸收入血化学成分进行活性分析,结果表明,真正的有效成分是有限的和少数的。

可见,由于将血清作为分析中药有效成分的切入点,就把本来十分复杂的问题大大地简单化了。

实践证明,我们提出“中药复方的药效为其主要有效成分和次要有效成分的综合效应”的观点比较符合实际。

而“两多论”只能使许多人对中药研究陷于茫然不知所措的境地。

4　确定吸收入血成分的生物活性和化学结构的方法411　吸收入血成分的确定实验动物一般选用大鼠,一组大鼠灌胃所试药物,另一组灌胃相同体积生理盐水。

给药后,将大鼠置于不锈钢制的代谢笼中收集大量尿液,从而富集了某些吸收入血的代谢物。

收取足够的尿液后,于给药后适当时间(估计血药浓度最高的时间)将大鼠剪头处死,接取血液,制备血清。

将上述尿液和血清用适当的溶媒萃取,回收溶媒后得到提取部分。

以薄板层析(TLC)、高效液相层析(HPLC)和电喷雾质谱(ESI2MS)等平行检查对照组和给药组尿液及血清提取物在谱图上的差异。

要根据已经掌握的复方中各种中药的已知化学成分,选择几种溶媒处理血和尿液样品。

在用HPLC检测样品时,为了防止漏检,不能只用一种检测器,最好用紫外检测器(UVD)、蒸发光散射检测器(EL SD)或电化学检测器(EC)等几种检测器进行检测,这样才能保证把样品中有和无紫外吸收的化合物都能检测出来。

实践证明,一般情况下,药物肠内菌代谢物可用TLC检测,尿样品经富集后,许多代谢物在HPLC谱图上显示明显,由于吸收入血成分在血清样品的浓度甚低,故往往在尿液样品中检出的成分,而在血清中却・11・难于检测到。

因此,我们非常重视尿液的富集和检测。

至于是否有些化合物仅在血和胆汁中存在,而其在尿液中却不存在的情况,尚难断言。

为防止这种情况出现,我们认为也应收集动物的胆汁进行检测。

我们也经常采集服药人的血清和尿液进行分析,确定吸收入血药物成分。

实践证明,综合应用TLC,HPLC或ESI2MS对服药动物和对照动物的尿液、血清和胆汁进行细致的对比检测分析,可基本上确定吸收入血成分。

412　吸收入血成分生物活性的确定用上述方法确定吸收入血成分后,对于可大量获得的样品,可用整体药理学方法确定其活性,对于暂时尚不能大量获得的样品,可用离体药理学方法或检测与整体药理有关的细胞因子分泌或作用的方法确定其活性。

如当我们用肠内菌代谢研究证明,人和大鼠灌服人参皂苷Rg1后,尽管其在肠道内被代谢成为几种代谢物,但只有代谢物Rh1被明显吸收入血。

由于目前尚难于大量获得Rh1,于是,我们首先观察Rh1对THP21细胞分泌细胞因子的影响,发现Rh1可促进THP21细胞分泌TNFα及其mR2 NA的基因表达。

进一步研究证明Rh1对离体肿瘤细胞有抑制作用,最后在整体抗肿瘤实验中也证实Rh1对几种移植性肿瘤有抑制作用。

复方有效成分的检测方法和程序更为复杂一些,如给大鼠灌服芍药甘草汤后,对每个吸收入血的代谢物,不但要检测其镇痛作用,而且还要检测其镇静和解痉作用,甚至还要观察各成分之间的配伍协同作用。

实践证明,在吸收入血的代谢物中,只有少数化学成分具有特定药理作用。

413　有效成分化学结构的确定如果灌胃给予的化合物为已知结构的苷类化合物,经检测其吸收入血的某一成分为活性成分,那么用ESI2MS就可直接确定其吸收入血成分的化学结构。

因为用ESI2MS,可直接捕捉检测样品中与已知结构苷类化合物及其代谢产物分子量相对应的准分子离子峰,然后再对各离子峰进行二级(直至三级、四级)质谱分析,根据次级碎片的脱糖规律基本上可以确定入血成分的化学结构。

对于出现于血及尿液中的有效成分为非苷类未知化合物,则不能用ESI2MS直接确定其化学结构,只能从尿液中将其富集或用肠内菌代谢的方法将其制备提纯后,按常规方法做光谱学分析后,才能确定其化学结构。

5　富集和制备吸收入血代谢物的方法用TLC,HPLC或ESI2MS等检测方法,通过对比分析对照组和给药组血清或尿液样品的谱图,可以确定吸收入血代谢物的存在。

但如何制备和获得一定量的代谢物,供给光谱学分析和生物检测。

就目前的制备技术来看,尚有一定难度。

我们实验室采取下述方法获得代谢物。

511　肠内菌代谢法制备代谢物当用TLC和HPLC对比分析血清、尿液和肠内菌代谢物,并证明在血清或尿液中均存在同肠内菌代谢物相同的成分时,即表明该代谢物是其前体化合物经肠内菌代谢后的产物。