中国人Y染色体微缺失分子诊断指南（草案）
2005.4 上海
前言
在精子发生障碍引起的男性不育患者中，Y染色体微缺失的发生率仅次于Klinefelter’s syndrome(克氏综合征)，是居于第二位的遗传因素。

Y染色体微缺失已成为男性不育患者的常规检查项目。

欧洲男科学协会和欧洲分子遗传实验质控协作网为提高诊断质量，在1999年和2004年先后发布了第一版和第二版Y染色体微缺失分子诊断指南。

经过多年的临床实践证明该指南准确、灵敏和易于操作。

2005年4月在上海召开了中国人Y 染色体微缺失分子诊断的研讨会，成立了Y染色体微缺失分子诊断协作网。

会议在欧洲指南的基础上起草了符合目前我国男性不育诊疗现状，并反应最新生物技术发展的中国人Y染色体微缺失分子诊断指南。

本指南重点讨论Y染色体微缺失分子诊断具体实施时的标准化和规范化，推荐的相关方法和设计是根据欧洲指南和我国已有的实验研究基础上综合而成。

对机理研究和背景知识介绍部分在本指南中不再详细讨论。

男性不育症患者Y染色体微缺失分子筛查适应症
常规检测的适应症：
1、男性不育症患者选择单精子卵泡浆内注射（ICSI）或体外受精（IVF）生育子代前；
2、非梗阻性无精子症患者；
3、严重少精子症患者（精子数目少于5×106/ml）；
4、无精子症患者进行睾丸活检术前；
5、男性不育症患者（如精索静脉曲张）手术前；
6、原因不明的男性不育症患者用药前。

推荐检测的适应症：
1、少精子症患者（精子数目少于20×106/ml）；
2、精子密度正常，但原因不明的男性不育症患者；
3、男性不育伴隐睾和精索静脉曲张的患者；
4、妻子有不明原因习惯性流产的患者。

诊断实验指南
Y染色体上存在影响精子发生的无精子因子（AZF）区域，进一步可分为AZFa,AZFb和AZFc三个区域。

Y染色体微缺失分子诊断实验利用多重聚合酶链反应（multiplex－PCR）特异性扩增Y染色体AZF区域的序列标签位点（STS），扩增产物用电泳或杂交等方法进行检测。

STS位点和PCR对照引物的设计原则
1、STS位点设计
AZF每个区域应设置2个STS位点，推荐以下6个STS位点为必须包含位点。

增加更多的位点或许有更多的科学发现，但其对临床指导意义有待进一步的探讨。

AZFa： sY84,sY86；
AZFb： sY127,sY134；
AZFc： sY254,sY255；
2、内部对照位点推荐如下：
sY14(SRY)和ZFX/ZFY，也可以选择Globin或G6PDH等其他看家基因作为内对照。

PCR方法
本指南推荐使用多重PCR技术。

由于多重PCR技术有内部互相对照的效果，可以分析阴性结果是否由操作失误引起，并提高效率，减少操作次数，减少出错可能。

对某些标本多重PCR结果有疑问时可选择单项PCR的方法。

本指南推荐每次PCR检测分成A、B两组进行。

每组包含AZFa、AZFb、AZFc区域各一对引物和两对内对照引物。

每组内的引物组合如下：
A组：sY14(SRY)、ZFX/ZFY、sY86、sY127、sY254
B组：sY14(SRY)、ZFX/ZFY、sY84、sY134、sY255
PCR扩增后检测方法
PCR扩增产物最常见的检测方法是琼脂糖凝胶电泳，本指南也予以推荐。

由于每个泳道有5条扩增产物，若其分子量相差太小，电泳时间将延长至几个小时甚至过夜。

为了提高效率，选择引物时注意各产物条带之间的长度差别是否足够大，电泳时间控制在1时以内比较合适。

PCR质量控制
Y染色体微缺失分子诊断实验操作要求严格按照相应分子诊断实验室规范和质量控制
的基本原则进行，合理的内对照和外部对照是控制实验质量的关键。

PCR时必须同时做外部阳性和阴性对照。

选择正常男性DNA样品为阳性对照，正常女性DNA样品为阴性对照，灭菌蒸馏水为空白对照。

实验结果的判断与优化
AZFc缺失是临床最常见的缺失类型。

若AZFc区域的sY254和sY255出现单个缺失，通常是实验错误所致。

如试剂设计不合理、标本保存或DNA抽提有问题。

AZFa区域的两个STS位点出现单个缺失非常罕见，在排除实验操作失误后，判断为AZFa 区域的部分缺失，但得出结论前应仔细复核。

AZFb区域情况类同。

对于PCR扩增，每个实验室应该结合各自的设备条件和DNA质量进行优化。

如果结果不明确或者怀疑技术方面失误，则应该重新扩增。

如果针对某一个特殊DNA标本，多重PCR体系效果不好，建议做单项PCR扩增。

同时也可以降低退火温度重复进行PCR扩增，至于循环次数并没有常规建议。

实验应该不断优化，直到结果清晰并且可重复为止。

Y染色体微缺失分子检测的临床意义
Y染色体微缺失遗传型与表型的关系已进行了大量研究，对临床有非常好的指导意义。

AZFa、AZFb和AZFc三个区域全部缺失的患者，100％表现为无精子症。

不可能通过任何手段从睾丸中获得精子。

AZFa区域整段缺失通常导致唯支持细胞综合征（SCO综合征），临床表现为无精子症。

如果诊断为整段AZFa区域缺失，若想从睾丸中获得精子进行ICSI已不大可能。

AZFb和AZFb+c整段缺失的典型睾丸组织学特征是SCO综合征或生精阻滞。

与AZFa区域整段缺失的情况类似，这种病人在睾丸穿刺时也找不到精子。

因此，不推荐给这类病人施行ICSI。

AZFc缺失的临床和睾丸组织学表型多种多样。

一般说来，AZFc缺失患者尚残存精子生成能力。

AZFc缺失见于无精子症或严重少精子症患者，罕见情况下，也可以在自然状态下遗传给其男性后代。

在无精子症患者中，AZFc缺失者通过TESE获得精子的机会要大得多，也可以进行ICSI受孕。

但这些患者的男性子代将是AZFc缺失的携带者。

另外，有研究发现AZFc区域缺失的少精子症患者，其精子数目有进行性下降的趋势，最后发展为无精子症。

因此，对AZFc区域缺失的少精子症患者,应及早进行治疗或将其精液
进行冷冻保存。

报告
Y染色体微缺失分子诊断结果应出具标准格式的打印报告，报告应包括以下内容：
1．实验室名称；
2．送检日期和报告日期；
3．患者信息如：姓名、出生日期和标本编号；
4．临床初步诊断；
5．标本种类（如：血液、精液等）；
6．采用方法（如：多重PCR扩增法）；
7．分析结果：推荐以表格形式描述不同的STS位点检测结果，避免采用“+”“—”来描述，因为这样容易误解，推荐采用文字（如：存在/缺失）来描述某位点的结果；
8．为了使临床医生更简洁地了解实验结果，并形象化地向病人解释，推荐实验报告中附电泳图和Y染色体的模式图。

建立质控网络（室间质控）
开展Y染色体微缺失检测的实验室应该加入相应的室间质控网络。

从质控中心的组织者获取的DNA标本应该与患者标本完全相同的方式处理，并出报告。

由于国内尚没有相应的质控网络，建议先以本次会议建立的Y染色体微缺失分子诊断协作网作为基础，探索建立区域性或全国性的质控网络。

附件1：报告单参考格式
附件2：检测申请单参考格式。