分子生物学实验室
实验一 氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验二 细菌质粒DNA 的提取
实验三 琼脂糖凝胶电泳
实验四 细菌基因组DNA 的提取与琼脂糖凝胶电泳
实验五 质粒DNA 限制性内切酶实验
实验六 聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因
实验七 胶回收法纯化DNA 与琼脂糖凝胶电泳
南京工业大学制药与生命科学学院
生物工程与技术基础实验与工程实训中心
《分子生物学实验》教学大纲
英文名称： Molecular biology
学分：1 学时：32
教学对象：生物工程专业、制药工程专业、药剂学专业、食品学专业、生物技术专业
教学目的：在开设的理论课程的基础上，结合实验课程的教学，使学生能较全面系统的掌握分子生物学的基本操作，拓宽专业知识面，加深对专业知识的理解，强化动手能力。

基本要求：了解分子生物学的实验操作原理，掌握有关实验仪器的使用方法。

实验内容：
实验一.细菌质粒DNA的提取及酶切实验 （8学时）
基本要求:
通过学习碱变性抽提法对大肠杆菌中的质粒的抽提，掌握质粒DNA的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA的原理。

进一步了解限制性
内切酶的特性及酶切反应过程，掌握DNA的酶切技术。

重点:
掌握质粒DNA的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA的原理。

进一步了解限制性内切酶的特性，掌握DNA的酶切技术。

难点:
掌握质粒DNA的小量制备方法及DNA的酶切技术。

实验二. 细菌基因组DNA的提取 （4学时）
基本要求:
了解细菌基因组DNA的提取的目的，原理，掌握细菌基因组DNA的提取的实验步骤及操作方法
重点:
掌握细菌基因组DNA的提取的实验步骤及操作方法
难点:
掌握细菌基因组DNA的提取的实验步骤及操作方法
实验三. 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验（4学时）
基本要求:
了解大肠杆菌感受态细胞的制备原理及转化反应的目的，应用范围及操作过程，掌握重组DNA质粒转化大肠杆菌的操作技术。

重点:
掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的操作技术
难点:
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验四. 聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因及琼脂糖凝胶电泳 （8学时） 基本要求:
熟悉聚合酶链反应（PCR）的基本原理、实验基本条件；了解 PCR反应条件的优化和注意事项和应用范围 掌握聚合酶链反应（PCR）的实验技术：了解核酸琼脂糖凝胶电泳的原理及操作步骤，掌握琼脂糖凝胶电泳的实验方法。

重点:
掌握掌握琼脂糖凝胶电泳的实验方法。

难点:
聚合酶链反应（PCR）的实验技术，琼脂糖凝胶电泳的实验方法。

实验五. 聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质 （4学时）
基本要求:
了解聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质的基本原理，学会用该法测定蛋白质分子量的操作技术。

重点:
掌握聚丙烯酰氨凝胶的配制方法，了解聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质的基本步骤及实验结果的判定
难点:
聚丙烯酰氨凝胶电泳的实验步骤及实验结果的判定
实验一 氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验目的
掌握重组DNA 质粒转化至大肠杆菌宿主的操作技术。

实验原理
带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA ,,该过程称之为转化过程。

受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl 2，RuCl 等化学试剂法）的处理后，细胞
膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。

实验步骤
1 感受态细胞的制备：
1) 挑菌37℃培养。

2) 将过夜培养的细菌转接培养2-3小时。

3) 将菌液置冰上10分钟，4℃离心8000rpm 30秒。

4) 用氯化钙溶液悬浮菌体，冰浴，离心弃去上清。

5) 氯化钙溶液悬浮菌体。

2 转化：
1) 取出感受态细胞,试剂A，无菌双蒸水和待转化的质粒DNA，均置冰盒内。

2) 取离心管管一支，将质粒、试剂A、无菌水，感受态细胞混匀冰浴20分钟。

3) 在管内加入400ul LB 液体培养基，振荡培养10-40分钟。

4) 涂布培养。

大肠杆菌形态图
实验二 质粒DNA 的提取
实验目的
本实验通过质粒快速提取试剂盒的试剂对大肠杆菌中的重组质粒pET-22b 的抽提，掌握质粒DNA 的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA 的基本原理。

实验原理
载体是基因工程所必需的工具，它用于将目的基因运载到宿主细胞内进行克隆与表达。

常用的载体有质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、逆转录病毒DNA 和昆虫病毒DNA 等，而质粒是最常用的载体。

实验步骤
1 收集菌泥。

2 悬浮细菌。

3 加入200μl 裂解液 (Solution 2)，充分裂解菌体。

4 加入400μl 絮凝剂(Solution 3)。

5 15000rpm 离心10分钟，无需低温离心。

6 将步骤5中的上清转移到吸附柱(3S)中，
12000rpm 离心1分钟。

7 将吸附柱放入同一支收集管中，吸取洗涤液到吸附
柱，离心1分钟。

8 重复步骤7一次。

9 将吸附柱放入同一支收集管中，高速离心2分钟。

10在吸附柱(3S)膜中央加50μl 无菌双蒸水，室温高速离心1分钟。

质粒图谱1 质粒图谱
2
质粒电泳图
实验三 琼脂糖凝胶电泳
实验目的
用来检测DNA的情况，如DNA片段分子量的大小、纯度等。

实验原理
利用琼脂糖凝胶电泳相对于标准DNA的移动度，可测定DNA片段的相对分子量。

一般800bp以上的片段用08%的琼脂糖凝胶，800bp以下的片段，用10%-20%的琼脂糖凝胶。

用溴化乙锭染色，在紫外灯下可以直接确定并分析DNA片段在凝胶板中的迁移率。

实验步骤：
1 将配好的电泳缓冲液，倒入电泳槽。

2 将琼脂糖凝胶放入微波炉熔化。

3 熔化后的琼脂糖凝胶倒入插好梳子的模具中。

4 静置1小时左右，等琼脂糖凝胶凝固后垂直拔去梳子。

5 将琼脂糖凝胶放入电泳槽中。

6 点样,一般上样量为10×Loading Buffer 05-1μl、DNA样品（质粒）3μl混匀，点入凝胶孔内。

7 质粒电泳参数：电泳仪的电压100V，电流500mA，功率250W。

电泳时间40分钟。

8 将琼脂糖凝胶取出，放入紫外与可见分析装置。

9 凝胶成像系统显像，拍照。

电泳图 凝胶成像系统
实验四 细菌基因组DNA 的提取
实验目的
本实验通过利用小量细菌基因组DNA 抽提试剂盒对大肠杆菌基因组DNA 的抽提，掌握细菌基因组DNA 的小量制备方法。

实验原理
本实验使用 溶菌酶破壁及蛋白酶K 消化以确保基因组DNA 得率。

不使用苯酚/氯仿等有机试剂，无须传统的乙醇沉淀、洗涤、干燥、溶解过程，简化了操作。

实验步骤
1 细菌的消化
2 加入 400 ul DL 液和 25 ul 蛋白酶 K，迅速温和地来回颠倒离心管彻底混匀。

温浴30 分钟。

离心 1 分钟后，取上清至另外一个离心管中。

3 加入 200 ul 异丙醇,离心弃去收集管中的液体。

4 加入 500 ul 洗涤液，离心 30 秒。

5 将吸附柱移入另外一个干净的收集管中。

离心 15 秒。

6 将吸附柱放入同一个收集管中。

离心 1 分钟。

7 在吸附膜中央加入 100 ul T1 液，离心 1 分钟。

将 DNA -20 ℃ 保存。

8 取纯化后基因组片段洗脱液2μl 加上样缓冲液 1μl 混匀，标准分子量DNA2-3μl，电泳检测结果。

大肠杆菌的细胞的结构 细菌基因组DNA
的结构。