鸡肝过氧化氢酶的提取、分离和纯化孙文刚云南民族大学化学与生物技术学院云南昆明摘要：新鲜鸡肝经匀浆、磷酸缓冲溶液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose离子交换层析、Sepharcy1 S -200凝胶过滤层析、得到鸡肝过氧化氢酶电泳纯制品。
回收率为18.23%，比活达4780.38U/mg，纯化倍数为66.15，最适温度为40℃，最适PH为7.0。
该酶在20～40℃，PH 5～8内稳定。
经凝胶过滤和SDS-PAGE测得该酶的全分子量为250KD,亚基分子量为62.5KD。
关键词：家鸡；肝脏；过氧化氢酶；分离纯化；性质Chicken liver Catalase of Extraction, Separation and PurificationWengang SunYunnan Minzu UniversityAbstract: A catalase was purified from Anas Chicken homogenation ,n-butanol disposal, ammo-nium sulfate precipitation, ion-exchange chromatography on DEAE-Sepharose Fast Flow column and gelfiltration chromatography on Sephacryl S-200.The purity of the purified catalase was confirmed by thepresence of a single band on SDS-PAGE.18.23% of the catalase activity was recovered. The specific activ-ity was 4 780.38 U/mg. The optimum pH and optimum temperature were 7.0 and 40℃ ,respectively. The catalase appeared to be stable at 20～40℃and pH 5～8,and it was 66.15-fold purified. Sephacryl S-200 chromatography and SDS-PAGE showed that the molecular weight of this catalase was 250 KD and itssubunit was about 62.5 KD.Key words: Anas Chicken; liver; catalase; purification; property引言过氧化氢酶(Catalase,EC1.11.1.6，简称CAT)是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶，酶分子结构中含有铁卟啉环,1个酶蛋白分子中含有4个铁原子[1]。
过氧化氢酶是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一[2]，催化细胞内过氧化氢的分解。
过氧化氢酶已成为农业及相关食品业、乳制品业、造纸业以及农业环保业中有价值的酶之一。
CAT主要以与细胞器，如线粒体、过氧化物酶体结合的形式存在,而在红细胞中则以可溶状态存在。
过氧化氢酶几乎普遍存在于所有能呼吸的生物体内，在哺乳动物的肝与红细胞中含量较高，国内外学者多从动物肝中提取[1,3-6],也有从血液、胎盘、贻贝、苹果以及微生物中提取的研究[7-13]。
但从鸡肝中分离纯化过氧化氢酶的研究未见报道。
为此，本文尝试从鸡肝中分离纯化过氧化氢酶并研究其相关的酶学特性。
1. 材料与方法1.1 实验材料家鸡肝脏取自健康活鸡,杀死后立即取肝脏于冰箱中冰冻保存备用[14]。
1.2 实验仪器紫外分光光度计、冷冻离心机、超声波破碎仪、可见分光光度计、离子交换柱、SDS-PAGE电泳装置、冰箱、酶标仪等。
1．3实验试剂Tris试剂、甘油、KCl、HCl、硫酸铵、牛血清蛋白、磷酸缓冲液、考马斯亮蓝G-250、95﹪乙醇、钼酸铵、过氧化氢、30%丙烯酰胺凝胶贮存液、SDS 聚丙烯酰胺等。
2．实验方法2.1 粗酶液的制备称取新鲜鸡肝100g,用自来水洗净，再用消毒双蒸水漂洗干净。
按1∶5(M∶V)的比例加入预冷的0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.2),用高速组织捣碎机捣碎,置于4℃冰箱抽提2h；离心(6000r/min,4℃,30min),收集上清液；加入硫酸铵至40%饱和度，离心(6000r/min,4℃,30min)去沉淀,上清中再加硫酸铵至60%饱和度，离心收集沉淀；将沉淀重溶于0.05 mol/L的磷酸缓冲液(pH 7.2)中,4℃透析夜，然后按1∶1(V∶V)的比例向透析液中加入预冷的正丁醇进行脱脂,4℃静置过夜.然后6000r/min离心,弃去沉淀以及正丁醇层,重复2次,得粗酶液。
2.2 DEAE-Sepharose离子交换层析DEAE-Sepharose离子交换层析柱为通用安玛西亚公司生产的DEAE Sepharose Fast Flow 5mL预装柱,用磷酸缓冲液(0.05mol/L,pH7.2)平衡至少4倍柱体积(20mL),上样5mL。
用0～1mol/L NaCl溶液(含0.05 mol/L,pH7.2的磷酸缓冲液)进行梯度洗脱,流速30mL/h,每管收集5mL,紫外监测波长为280nm;测定各管过氧化氢酶活性和蛋白含量;收集活性较高的各管酶液,4℃透析过夜,冷冻干燥后进行凝胶过滤。
2.3 SephacrylS-200凝胶过滤柱层析SephacrylS-200凝胶柱按产品说明书要求处理,装柱(16mm×835mm)后,用磷酸缓冲液(0.05mol/L,pH7.2)冲洗一定体积,上样2mL。
用磷酸缓冲液(0.05mol/L,pH7.2)进行洗脱,流速18mL/h,每管收集3mL；测定每管过氧化氢酶活性和蛋白含量;收集活性较高的各管酶液,4℃透析、冷冻干燥,得到过氧化氢酶纯品。
2.4 过氧化氢酶活性测定以过氧化氢为底物,采用钼酸铵终止法[15]:取0.16 mol/L的过氧化氢溶液0.2mL,加入 1.29mL磷酸缓冲液(0.05mol/L,pH7.2)中,37℃温浴5min,再加入0.01mL过氧化氢酶液,立即混匀并计时1min,然后加入1.5mL 32.4mmol/L钼酸铵溶液终止反应,405nm测定其OD值；以先加钼酸铵,再加酶液的为对照.过氧化氢酶活性单位定义为:每分钟分解1μmol过氧化氢所需的酶量为一个酶活力单位。
2.5 蛋白质含量测定按Lowry法[16]和分光光度法[17]进行测定,以牛血清白蛋白为标准样品。
2.6 蛋白质分子量测定用凝胶过滤[18]和SDS-PAGE测量其全分子量和亚基分子量,SDS-PAGE的分离胶浓度为12%,电泳后用考马斯亮蓝R-250染色。
2.7 最适pH及pH稳定性37℃下,分别测定过氧化氢酶在不同pH(3～12)[19]缓冲液下的酶活性以及4℃放置48 h后的酶活性。
2.8 最适温度及热稳定性分别测定过氧化氢酶在不同温度(25～70℃)[20]下的酶活性,以及在上述不同温度下分别保温10,30,60min后酶的活力。
的测定2.9 反应初速度V在最适条件下,在1～2 min内,每隔20s测定一次过氧化氢酶活性,以时间为横坐标,以底物浓度的减少量为纵坐标作图,得一直线,其斜率即是酶促反应的[21]。
初速度V2.10 酶Km值及Vm的测定在最适条件下,以不同浓度的过氧化氢为底物,测定其酶活性,并按双倒数法(Lineweaver-Burk法)作图[22],求出Km以及Vmax,底物浓度范围设置为4.7～37.5mmol/L。
2.11 金属离子对酶活性的影响在测活体系中加入不同的金属离子,使金属离子的终浓度达到 1 mmol/L,4℃放置48h后,37℃下测定活性,以不加金属离子的酶活力为100%.金属离子分别为:Pb2+,Ba2+,Cu2+,As3+,Mg2+,Mn2+,K+,Cr3+,Ag+,Fe2+。
2.12 化学试剂对酶活性的影响在体系中分别加入不同浓度的化学试剂EDTA、抗坏血酸、尿素,4℃放置48h后,37℃下测定活性,以不加化学试剂的酶活力为100%。
3. 结果与分析3.1 鸭肝过氧化氢酶的分离纯化粗酶液经DEAE-Sepharose离子交换层析柱后,所得结果如(图1)所示,收集有活性的各管洗脱液,经透析、浓缩后,再经过Sephacryl S-200凝胶柱,所得结果如(图2)所示.纯化后的过氧化氢酶经SDS-PAGE,显示为一条带(图3),说明该酶纯化已经达到电泳纯,酶的整个分离纯化结果见表1.图1. 鸡肝过氧化氢酶的DEAE Sepharose离子交换柱层析图2. 鸡肝过氧化氢酶的Sephacryl S-200凝胶柱层析M．分子标准样品marker；1.鸡蛋清溶菌酶14.4KD；2.胰蛋白酶抑制剂20.1KD；3.牛碳酸酐酶31KD；4.兔肌动蛋白43KD；5.牛血清蛋白66.2KD；6.兔磷酸化酶B 97.4KD；S.过氧化氢酶图3.鸡肝过氧化氢酶SDS-PAGE电泳表1.鸡肝过氧化氢酶的分离纯化3.2 鸡肝过氧化氢酶分子量测定SephacrylS-200凝胶层析测得鸭肝过氧化氢酶的全分子量为250KD,SDS-PAGE法测定其多肽链分子量为62.5KD，表明鸭肝过氧化氢酶由4条相同的多肽链组成。
3.3 过氧化氢酶的最适pH与pH稳定性实验结果表明,鸡肝过氧化氢酶在pH 7.0左右时活性最强,pH 5.0～7.5活力较高,超出其范围活力较低(图4)。
鸡肝过氧化氢酶在pH 3～8的范围内是比较稳定的,在pH 5～8的范围内活性基本保留原有活性的90%以上,pH 9.0时,残余酶活力不到60%(图5)。
图4. PH对鸡肝过氧化氢酶活力的影响图5.鸡肝过氧化氢酶的PH稳定性3.4 过氧化氢酶的最适温度与热稳定性实验结果表明,鸡肝过氧化氢酶的最适温度为40℃左右(图6),20～40℃具有较好的热稳定性,保温60min活性保留原有活性的90%以上。
该酶60℃保温60min活性丧失50%以上,65℃保温10min活性损失殆尽(图7)。
图6.温度对鸡肝过氧化氢酶活力的影响图7.鸡肝过氧化氢酶温度稳定性的测定3.5 酶促反应初速度V过氧化氢酶催化过氧化氢的反应初速度的测定结果见图8,得出回归方为373.60μmol/(L·min)。
程:y=46.111x+70.713,可求出其反应初速度V图8.酶促反应初速度3.6 米氏常数Ks以及Vm的测定在最适条件下,测定底物浓度为 4.69,9.38,14.06,18.75,28.13,37.50 mmol/L的反应速度,按测定结果计算1/[S]和1/V,并按双倒数法作图,得到线性回归方程:y=5.9853x+0.1606,求得过氧化氢酶的Km值为37.29mmol/L(图9)。