文章编号押2096-4730穴2019雪03-0205-05南极磷虾脂类成分的抗炎活性研究田晓清1，常俊男1，2，李月月1，2，陆亚男1，樊成奇1(1.中国水产科学研究院东海水产研究所，水产品质量安全与加工实验室，上海200090；2.上海海洋大学食品学院，上海201306)摘要：南极磷虾油具有抗炎功效，但功效成分类型和作用靶点并不明确。
本研究精制获得磷虾油抗炎有效部位磷虾轻油乙酯，通过HPLC分析明确其中EPA+DHA乙酯含量>60%，体外抗炎活性结果显示磷虾轻油乙酯具有较强活性，且呈剂量相关，其抗炎作用主要表现为抑制炎症因子NO、IL-6；磷虾极性脂磷脂平均含量达到65%，但抗炎活性微弱。
关键词：南极磷虾；磷虾轻油乙酯；抗炎活性中图分类号：S912文献标识码：AStudy on Anti-Inflammatory Activity of Lipids from theAntarctic Krill(Euphausea superba)TIAN Xiao-qing1,CHANG Jun-nan1,2,LI Yue-yue1,2,et al(1.East China Sea fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Shanghai200090;2.College of Food Sciences&Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai201306,China)Abstract:The Antarctic krill oil has been proved beneficial for treatment of inflammatory disorders,but the types of effective components and targets were not clear.Ethyl ester fraction of light oil from Antarctic krill was obtained in this study,and it has strong anti-inflammatory activity in a dose-dependent manner.Its anti-inflammatory effects mainly acted as inhibition of inflammatory factors NO and IL-6.The relative contents of EPA and DHA ethyl esters are more than60%by HPLC.The total krill phospholipid fraction has phospholipid contents higher than65%on average,but showed weak anti-inflammatory activity.Key words:Euphausea superba;EPA and DHA ethyl esters;anti-inflammatory activity南极磷虾Euphausea superba脂类营养成分含量丰富，其脂肪酸中二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)相对含量高于15%，总磷脂含量达到油脂提取物的30%以上，南极磷虾中还含有总虾青素高于3mg·100-1·g-1[1-3]。
目前，南极磷虾油(krill oil)是相关产品中营养功效和附加值都很高的产品，挪威的Aker Biomarine公司开发成功的磷虾油SKO(superba TM krill oil)已畅销欧美市场，商业利润极大。
南极磷虾油除了具有改善大脑健康、提高免疫、抗肿瘤等许多医疗保健功能外[4]，还具有一定抗炎功收稿日期：2018-08-17基金项目：中国水产科学研究院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(2016HY-ZD0903)作者简介：田晓清(1986-)，女，内蒙古赤峰人，研究方向：天然产物化学.E-mail:tianxq@通信作者：樊成奇（1973-），男，研究方向：天然产物化学.E-mail:fancq@206浙江海洋大学学报穴自然科学版雪第38卷效[5]，但功效成分类型和作用靶点未见文献报道。
本研究以粗磷虾油为原料，根据脂肪酸和磷脂理化性质差异，精制获得不同部位，并利用体外模型进行了抗炎活性筛选。
1实验部分1.1仪器与材料1.1.1仪器不锈钢豆浆机(DJ12B-DSG1型)，广东美的精品电器制造有限公司；旋转蒸发仪(RE-3000)，上海亚荣生化仪器厂；低温冷冻离心机(TS-211C)；高效液相色谱仪：Agilent1260HPLC，VWD可变波长检测器，OpenLab CDS色谱工作站；Shimadazu，LC-20AT pump，SIL-20A auto sampler，SPD-M20A PDA；高速逆流色谱(TBE-300C)，上海同田生物技术股份有限公司。
1.1.2实验材料生物材料：冰冻南极磷虾(方砖：80cm×40cm×10cm)来自2014年冬季南极磷虾探补渔船，-78℃冰冻保存，使用前1周转移至-18℃冷冻保存备用。
试剂：预制GF254TLC硅胶板(青岛海洋化学公司)；液相用乙腈和甲醇(色谱级，Tedia，USA)；其余溶剂、试剂均为分析纯(上海国药集团)。
1.2方法1.2.1提取根据文献[3]报道，在室温条件下，分别取3批次冰冻磷虾，每批次1200g，采用固液比1:2.5、提取时间5min、混合溶剂EA/BuOH比例为1:1的条件提取。
真空浓缩干燥后，分别获得磷虾粗油48.8g、53.2g、49.0g，提取率分别为4.07%、4.43%、4.08%。
1.2.2分离和酯化3份磷虾粗油首先分别经10倍体积(v·m-1)的无水乙醇沉淀除去固体杂质，再分别用10倍体积(v·m-1)的丙酮在4℃沉淀过夜，离心分离得到浅黄色膏状物磷虾极性脂和深红色透明磷虾油。
其中，分别获得3份极性脂11.1g、12.9g、13.3g，产率分别为22.8%、24.2%、27.2%；所得磷虾极性脂利用HPLC(Agilent 1260)外标法，以卵磷脂、磷脂酰乙醇胺为对照品，在206nm测定了极性脂中磷脂总含量。
获得的深红色透明磷虾油分别为38.7g、40.3g、35.7g，产率分别为77.2%、75.8%、72.8%，脂肪酸成分未作分析。
称取40g磷虾油，利用乙醇钠/乙醇回流4h进行乙酯化，用0.5M的稀盐酸中和，蒸出乙醇后用正己烷萃取、回收油相浓缩得粗轻油乙酯；进一步利用高速逆流色谱分离提纯，单次进样量800mg，收集得到EPA+DHA乙酯含量较高的磷虾轻油乙酯混合物，重复多次进样，合并收集的洗脱液，真空浓缩干燥后到磷虾轻油乙酯11.3g。
并利用HPLC(Shimadazu20AT)在215nm归一化法分析了磷虾轻油乙酯纯化产物中EPA+DHA乙酯含量。
1.2.3抗炎活性测试在抑制LPS诱导的巨噬细胞NO生成实验中，通过Griess反应测定小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的NO生成。
实验分为空白、对照组、LPS诱导模型组、受试化合物组(实验组)。
RAW264.7细胞以5.0×105·mL-1密度接种于96孔板中，于温度37℃，5%CO2的条件下，使用DMEM培养液培养24h。
空白对照组细胞不做处理；LPS模型组细胞加入500ng·mL-1LPS刺激24h。
各给药组分别给以受试物预孵30min,然后加入500ng·mL-1LPS刺激24h。
取50μL细胞上清液，依次加入等体积Griess试剂A、Griess试剂B，轻轻振荡数次，待各孔反应液完全混匀后，于540nm波长检测各孔OD值，根据公式计算NO抑制率。
采用ELISA方法检测磷虾极性脂、轻油、轻油乙酯对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7中IL-8和IL-6细胞因子表达水平的影响。
实验设置空白对照组、模型组、给药组，RAW264.7巨噬细胞以5.0×105·mL-1密度接种于96孔板中，每孔100μL培养基，培养24h。
空白对照组细胞不做处理，模型组加LPS500ng·mL-1刺激24h，分别加入相应浓度受试物预孵30min后，加入LPS500ng·mL-1刺激24h。
IL-8，IL-6蛋白表达标准曲线按照如下步骤制作：第3期图1卵磷脂标准曲线图Fig.1Standard curve of thephosphatidylcholine图2南极磷虾油中测得卵磷脂样品图Fig.2Liquid chromatogram of phosphatidylcholine in the Antarctic krill 图3样品中EPA+DHA 的HPLC 图谱Fig.3Liquid chromatogram of EPA+DHA in theAntarctic krill 田晓清等：南极磷虾脂类成分的抗炎活性研究①加入标准品稀释液到冻干标准品IL-8或IL-6中，待彻底溶解后，静置15min 混匀(浓度为2000pg ·mL -1)。
标曲使用以下浓度：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0pg ·mL -1。
②除空白孔外，分别将不同浓度标准品(100μL/孔)加入反应孔，用封板胶纸封住反应孔，37℃温箱孵育90min ，用洗涤液洗板4次。
③每孔加入生物素化抗体工作液100μL ，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育60min ，洗板4次。
④每孔加入酶结合物工作液100μL ，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育30min ，洗板4次。
⑤每孔加入显色剂100μL ·孔-1，避光反应10~20min 。
⑥每孔加入终止液100μL ·孔-1，混匀后即刻测量450nm 处吸光度OD 值。
⑦标准品的OD 值减去空白孔的OD 值，以标准品浓度作横坐标，OD 值作纵坐标，绘制标准曲线。
收集各个受试样品组的细胞培养液上清，取100μL 加入反应孔中，设2个复孔，余下步骤同上，根据标准曲线，计算每组IL-8，IL-6蛋白的表达情况。
2结果与讨论2.1南极磷虾脂质不同组分的制备根据文献分别提取3批次冰冻磷虾，获得磷虾粗油提取率达到4.07%、4.43%、4.08%，稍低于文献[3]报道，除所用南极磷虾原料不同外，提示应随着原料用量增加，适当延长剪切提取的循环时间。