插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质 粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。


第三节 植物转基因技术在植物品种改良 中的应用
控制果实成熟的转基因植物 抗病虫害的转基因植物 抗除草剂的转基因植物 改变花卉形状和颜色的转基因植物 抗环境压力的转基因植物 产高品质产物的转基因植物
“转基因逃逸”造成的危害： 诱发害虫和野草的抗性问题 诱发基因转移跨越物种屏障 诱发自然生物种群的改变 基因污染 食物链的破坏
④Ori区(origin of replication，复制起 始区)：Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我 复制。
(2). 农杆菌的感染和生存
第一步:植物受伤 乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮诱导Ti 质粒的毒性基因表达。 第二步 感染植物 脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位 第三步 毒性基因（vir）表达 第四步 T-DNA转移 单链T-DNA被切下来，整合到植物基因 组中。 第五步 诱导冠瘿瘤
(5) 天然Ti质粒作载体的缺点

野生型Ti 分子大（200kb）操作起来十分麻烦； 各种限制型酶切位点多，切割产生很大片段。且单 一的酶切位点很少； tms和tmr 基因产物干扰植物内源激素的平衡，产 生冠瘿瘤，阻碍转基因植物细胞的分化和再生； 无大肠杆菌的复制起点和作为转化载体的选择标记 基因。

①pGV3850 特点：外源基因不能直接插入，需要借助 于pBR322质粒作为中间载体 选择标记 脓杆菌选择标记 宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载 体pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基 因。卡那霉素抗性（ Kanr ）基因（卡那 霉素对植物有剧毒！） 最终受体植物的选择标记 位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基因 （nos）。
左 外源基因 右 感染植物
进入植物细胞核， 整合，表达
Vir 左 外源基因 右
农杆菌
双元系统的特点

双元系统是穿梭质粒和Ti质粒两个质粒 ，在接合 后可以自主性地共存于同一农杆菌细胞中。 穿梭质粒编码植物选择标记、表达信号、多克隆 位点、两个T-DNA
பைடு நூலகம்

双元系统中的 Ti 具有Vir基因和农杆菌复制起始 子(OriA)，但没有T-DNA边界序列。 接合后，两个质粒可以自主共存于同一农杆菌细 胞中。 穿梭质粒可在农杆菌内自主复制
（二）载体介导法

Ti 质粒介导的整合转化程序

植物病毒介导的转染程序（略）
1 Ti 质粒介导的整合转化程序

Ti 质粒的结构与功能
双子叶植物尤其豆科植物的根部常常会由于植物根部
被土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）形成根瘤，
其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒 Ti质粒（ Tumor-inducing plasmid）介导的，又称肿瘤诱导 质粒。
第八章 植物基因工程

转基因植物 将外源基因导入植物细胞，经组织培养， 获得能够表达外源基因的植物称为转基因 植物。 抗虫 抗病 抗逆 生产药物
第一节 植物的转基因技术

植物细胞培养技术
植物转基因技术的基本路线
转基因的受体系统 外源基因导入植物的方法
一、植物转基因技术的基本路线 分离目的基因 将目的基因与载体连接，形成重组DNA 利用细菌繁殖扩增重组DNA 将与表达载体相连的重组DNA导入到目标植 物的细胞中 筛选转化细胞，并诱导产生转基因植株 转基因植株大规模种植
染色体上
转化后可诱导愈伤组织分化成转基因植物
共 整 合 转 化 程 序
②双元载体（binary vectors） 能在大肠杆菌和农杆菌中复制，是穿梭载体。 双元载体的结构 Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、 vir基因。 大幅度减小质粒的体积。（<10kb）
Ti的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合）

改造后的Ti质粒载体模式
ori
(7) Ti载体的类型

共整合载体（cointegrate vectors） 由比利时科学家P.Zambrisky等1983年改造 的pGV3850 受体载体，需要同源重组才能插入外源基因。 双元载体（binary vectors） 既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点， 是个穿梭载体。
T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。
(3).Ti质粒转化的对象 裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶 植物（玉米） (4). Ti质粒作为载体的可能性 能够自发地整合到植物的染色体上。 能转化多种植物。 强启动子 T-DNA的opine合成酶基因上有一个强 启动子，能启动外源基因的表达。

转基因育种的程序
基因分离 体外重组
载体的构建
农杆菌介导 基因枪轰击
转化 转化体
筛选 遗传稳定性 评价
结合常规育种 转基因品种
安全性评价
市场开发
七、转基因生物潜在危害
转基因植物引发的安全事件

英国Pusztai事件 康奈尔大学斑蝶事件 加拿大“超级杂草”事件 墨西哥玉米事件

中国Bt抗虫棉事件
潜在危害 转基因食品可能具有毒性 ; 转基因食品可能产生过敏反应; 抗生素标记基因可能使人和动物产生抗药 性; 病毒重组,发生基因重组,产生新的病毒,产生 变异,或产生新病毒 转基因作物的生态安全性问题转 基作物本身可能演变为农田杂草

对生态环境的影响：植物的“转基因逃逸” 种苗的散失/残缺组织的再生 花粉的传播

三、外源基因导入植物的方法 （一）DNA直接转移法 化学刺激法 PEG、PNA（肽核酸）、磷酸钙、氯化钙 电击法 基因枪法 花粉通道法 将外源DNA片段在自花授粉后的特定时期注入 柱头或花柱，外源DNA沿花粉管通道或传递 组织通过珠心进入胚囊，转化不具备细胞壁 的受精卵，合子或早期胚体细胞。
双元载体的转化 基因插入 转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大 肠杆菌里操作。 帮助质粒（ helper plasmid） 受体农杆菌内要求带有整套vir基因（但缺 失T-DNA及左右边界）的“帮助质粒”提 供vir产物。
E.coli 左 外源基因 右 双元载体 转化
农杆菌 Vir 帮助质粒


（6）Ti 质粒的改造
除去 T-DNA 上的 tmt ， tms 和 tmr 生物合成 基因； 除去 Ti 质粒的其它非必需序列， 安装大肠杆菌复制子，

安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因， 使用植物基因的启动子和polyA化信号序列； 插入人工多克隆位点，以利于外源基因的 克隆。
生长素 细胞分裂 左边界 基因 素基因
tms tmr
冠瘿碱 合成
tmt
右边界
②毒性基因（vir） 决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转 移， 进入和整合。使根癌农杆菌表现出毒性。 ③Con 区(regions encoding conjugations，接合转移编码区)：该区 段上存在与细菌间接合转移的有关基因， 调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移。
外源基因插入pGV3850 的过程
pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同 pGV3850重组。只有这样，土壤农杆菌才能得 到抗卡那霉素性状。 外源基因
插入
Kanr pBR322
转化
抗卡那霉素 卡那霉素筛选 土壤农杆菌 的土壤农杆菌 pBR322与 pGV3850重组 含pGV3850 感染 外源基因 胭脂碱筛选 植物组织 表达鉴定 整合到
（1） Ti 质粒的图谱区 整个质粒160 -240 kb T-DNA区、 Vir区、 Con区、 Ori区
①转移DNA T-DNA（transfer-DNA） T-DNA 12 -24 kb tms的编码：合成吲哚乙酸 tmr的编码：合成植物分裂素 tmt的编码：合成氨基酸衍生物冠瘿碱 在T-DNA 的两端还含有左右2 个边界，长为 25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具 有重要意义。