植物抗逆机制及相关基因工程研究进展黎昊雁Ξ　徐　亮(浙江检验检疫局) 摘　要　环境因子和病虫害等严重影响农作物的正常生长发育和产量。

研究植物抗逆机制,利用基因工程的方法培育抗逆植株具有重要意义。

就植物耐盐、重金属、寒冻、氧化等非生物胁迫和抗真菌、虫类、病毒等生物胁迫方面的机制及其相关基因工程进展进行了讨论。

关键词　抗逆机制　基因工程1　前言植物生长的外在条件如温度、湿度、土壤中水分、盐浓度等发生急剧变化或大气污染(如S O2、臭氧)、紫外线辐射、农药及病原体等作用于植物时,会影响其生长发育。

全球由于环境胁迫给作物造成的品质下降、产量降低的损失是惊人的,因而了解植物抗逆机制,提高植物抗逆性有着巨大的实用价值和经济意义。

近年来,研究植物抗逆机制,并利用基因工程策略增加抗逆性物质在植物体内的含量,从而获得耐逆转基因植物已取得一定进展,本文就此作一综述。

2　耐盐机制及相关基因工程进展植物的耐盐机制十分复杂,生物学家对其进行了大量研究,发现与以下几种机制有关:(1)积累小分子渗透保护剂,如脯氨酸、甘氨酸甜菜碱、胆碱、三甲基甘氨醛、二甲基甘氨酸、肌醇及其甲基化衍生物、甘露醇、山梨醇、环状多元醇等。

例如脯氨酸,它水合趋势大,水合能力强,是水溶性最大的氨基酸,它的积累有助于细胞和组织的保水,从而保护酶和细胞结构;多元醇类则似乎在两方面起作用,一是渗透调节,二是渗透保护,这两方面有机地结合在一起。

相应地,这些保护剂生物合成途径中的关键酶基因成为了重要的耐盐基因,如脯氨酸生物合成过程中的P5CR(吡咯啉-5’-羟酸还原酶)、P5CS (吡咯啉-5’-羟酸氧化酶)、甘氨酸甜菜碱合成过程中的关键酶C M O(胆碱单氧化酶)和BADH(甜菜碱醛脱氢酶)、甘露醇和肌醇生物合成所需酶基因ImtD(1-磷酸-甘露醇脱氢酶基因)等。

(2)离子区域化,维持离子平衡,从而保持细胞和组织的内稳状态。

如H+—ATPase是质膜与液泡膜上的一种H+泵,可维持细胞质的Na+,Cl-浓度。

Na+/H+逆向转运蛋白则在外界环境的Na+浓度提高时,通过Na+/H+逆向转移将Na+转运到液泡中,实现区域化,从而减少细胞质中的Na+浓度。

H+—ATPase基因和Na+/H+逆向转运蛋白基因等与离子平衡有关的基因是耐盐基因工程研究的对象之一。

(3)脱落酸积累。

脱落酸是一种植物激素,可促进叶子脱落和芽的休眠,并诱导抗胁迫基因的表达。

(4)产生和积累高盐诱导表达的大分子蛋白,如调渗蛋白、水通道蛋白,可协助水分子在细胞间的转运;晚期胚胎发生富集蛋白(LE A)则具有中和浓度过高的离子、水通道、保护细胞膜等的作用,从而使细胞免受水势降低的损伤[1]。

编码这些大分子蛋白的基因均是耐盐基因工程的潜在的分子工具。

探讨植物耐盐机制,分离与克隆耐盐相关基因,并通过其转化获取耐盐转基因植物,对于开发盐碱和干旱地区的土地,改造世界上6000万公顷被盐化损伤的农田有着重要意义。

K ishor P BK[2]等人将P5CS基因导入烟草中,发现其脯氨酸含量明显提高,耐盐性得到改善。

美国加州大学Blum wald、加拿大多伦多大学H ong-X ia Zhang等将钠转运蛋白基因导入西红柿中,获得了耐盐植株。

中国水稻研究所黄大年研究员主持的转基因水稻研究近来获得了重大进展,胆碱单氧化酶等5个耐盐相关基因被成功导入水稻中,得到了可在0.75%NaCl 环境中生存的植株。

因此将沙漠变成绿洲,用海水灌溉农田并不只是一个梦想。

2　耐重金属机制及相关基因工程进展重金属对植物体的毒害作用主要是由于其与生物大分子的结合造成的。

其可与酶的活性中心或活性蛋白的巯基结合,导致蛋白质构象变化,酶活性丧失,干扰细胞的正常生理和代谢;其还可通过生物体内的氧化还原反应,产生自由基而导致细胞的氧化损伤。

不同植物对重金属的耐性机理不同,概括起来包括以下几个方面:(1)排斥机制,即阻碍重金属的吸收或其在植物体内的运输,吸收后又排出体外。

(2)区域化机制,即使重金属在植物的液泡、叶片表皮毛、细胞壁等特定部位积累,从而与细胞中的其他组分隔离,达到解毒的效果。

(3)络合机制,即植物体内物质与重金属的络合作用。

包括与无机物络合形成硫化物,与小分子有机物如谷胱甘肽(G SH)、草酸(oxalic acid)、组氨酸(His)、柠檬酸盐(citrate)等络合后在液泡中聚集,与大分子的金属螯合蛋白络合。

其中大分子金属螯合蛋白的螯合能力最强,它又可分为金属硫蛋白与植物螯合肽。

前者是一种低分子量、富含半胱氨酸残基的金属结合蛋白,由于其巯基含量高,对重金属的亲和力大,因而对多种重金属都具有螯合作用,其由MTs基因直接编码合成,在特定条件下如重金属离子胁迫或其他逆境条件下表达。

后者也是一种巯基含量很高的蛋白质,广泛存在于植物界中,可与重金属离子结合形成螯合物后从细胞质向液泡中转运并在液泡中积累,其是以谷胱甘肽为底物,在G CS(γ-G luCys合成酶)、G S(G SH合成酶)、和PCS(植物螯合肽合成酶)的作用下合成的[2]。

与上述机制相关的基因,如与具有重金属络合能力的・35・Ξ黎昊雁:女,1976年生,毕业于浙江大学生命科学与技术系,已发表论文2篇。

物质的生物合成有关的基因、与低毒络合物转运有关的基因等对于耐重金属基因工程的发展都有着潜在的利用价值。

重金属对土壤和水体的污染已十分严重,特别是酸雨或生态的变化使一些非溶解性重金属也被溶解,对植物的发育生长产生不良影响。

耐金属基因工程的发展有助于解决这些问题,并通过生物修复被污染的水体与土壤。

哥斯达黎加《熔炉》科技杂志报道了玛尔塔・巴尔斯德的科研小组用基因枪法转化水稻植株,获得了具有耐铝能力的水稻新品种。

4　抗冻机制及相关基因工程进展细胞生理学家认为,冻害主要是由于冰晶对生物原生质损伤造成的。

生活在寒带和寒温带海洋和陆地上的许多鱼类与昆虫,为适应寒冷环境,都能产生大分子抗冻物质。

其中研究较为透彻的是鱼类的抗冻蛋白(antifreeze protein,AFP),它可有效地减缓细胞中冰晶形成的速度,改变冰晶结构与大小,与冰晶结合从而降低体液冰点,还能通过与细胞表面和离子通道的相互作用,保护细胞膜免受低温破坏,阻止离子渗漏,提高鱼类在低温环境中的生存能力[4]。

抗冻蛋白可分为抗冻糖蛋白、第一类抗冻肽、第二类抗冻肽及第三类抗冻肽,是一个大小和序列都具有异质性的分子群体,由多基因家族编码。

近来,科学家们又发现了活性更强的昆虫抗冻蛋白和植物、细菌中的冷诱导蛋白及控制它们的基因。

这些研究成果都为植物抗冻基因工程提供了良好基础。

将抗冻蛋白基因导入植物可使其在低温环境中免受冻害。

James cole报道了加拿大Delhi研究所从深海大头鱼中分离到抗冻基因,转移到烟草后获得了抗冻品种[5]。

Sallis将合成的植物凝集素-抗冻蛋白基因导入马铃薯,使其耐冻能力提高[6]。

我国科学家傅桂荣等将美州拟鲽抗冻蛋白基因转入番茄,这种转基因番茄植株耐低温能力大,有望抵御北方晚秋凌晨低温的伤害[7]。

抗冻蛋白基因还被导入了玉米、桃树等植物中,抗冻蛋白基因工程有着巨大的发展潜力。

5　抗氧化机制及相关基因工程进展环境胁迫会使植物体内产生大量活性氧,虽然其在有些代谢过程中可被有效利用从而帮助植物抵御病原体侵袭,但活性氧不及时清除将会造成分子间和分子内的交联,产生多种氧化损伤,如蛋白质损伤、膜脂过氧化、碱基突变、DNA断裂等。

植物体内清除活性氧的保护机制主要包括2种:(1)酶促脱毒机制。

过氧化物歧化酶(S OD)是植物抗氧化系统的第一道防线,可清除细胞中多余的超氧根阴离子,抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化氢酶(G AT)均是清除H2O2的主要酶类。

(2)非酶促清除机制。

非酶类抗氧化剂包括类黄酮、α-生育酚、抗坏血酸、谷甘胱肽、胡萝卜素和甘露醇等。

这些物质既可直接同活性氧反应,将其还原,又可作为酶的底物在活性氧的清除中起到重要作用。

如抗坏血酸和谷甘胱肽可清除过氧化氢,甘露醇可清除氢氧根离子[8]。

对S OD基因家族、APX 基因、G AT基因和非酶类抗氧化剂生物合成过程中的关键酶基因的研究为植物抗氧化基因工程提供了工具。

Shen B (1997)等报道了将细菌编码的甘露醇-1-磷酸脱氢酶Mt1D 转入烟草中,体外实验表明转基因植株叶绿体中有甘露醇积累,清除OH-的能力增强[9]。

几种S OD的cDNAs已从植物中得到克隆并用来转化不同植物,S OD在转基因烟草、苜蓿、土豆、棉花中的表达提高了它们抗臭氧、辐射等氧化胁迫的能力。

6　抗病机制及相关基因工程进展6.1　抗病机制有关植物抗病机制的理论包括:(1)基因对基因假说(gene -for-gene hypothesis),由Flor于1947年提出,基本要点是:病原与寄主的关系分亲和与不亲和两种类型,亲和与不亲和的病原分别含毒性基因vir和无毒基因avr,亲和与不亲和的寄主分别含感病基因r和抗病基因R,仅当植物与病原具有相匹配的R(受体分子)、avr(信号分子)基因对时,两者才互作诱发特异的抗性反应[10]。

(2)与亲和因子相关的机制,由Scheffer 提出,其基本内容是病原所具有的与互作相关的基因,仅导致病原与其寄主发生亲和性互作,抗病是通过修饰病原合成的亲和性因子,修饰或缺失亲和性因子的作用受体来实现的[11]。

(3)病毒病害与真菌、细菌等病害的机制不同,病毒病转基因抗性机制是转录后基因沉默,即入侵病毒RNA基因组中包含有与植物转基因或内源基因同源的片段时,寄主植物即产生针对病毒RNA的互补的反义RNA,从而将病毒RNA破坏,达到抗性目的[12,13]。

科学家们正在试图寻找植物防御系统与动物免疫系统的对应性与进化上的同一性[10]。

6.2　抗病基因工程进展6.2.1　抗真菌、细菌植物抗病基因工程首选的目的基因是来自植物本身的抗病基因R,目前已成功得从植物中克隆到至少16个R基因,用它们来转化植株,安全性较高。

病原体无毒基因avr的利用可改善转基因植物抗性单一的问题,将avr基因与相应R基因共导入植物内,然后置于可受各种非专化病原诱导的启动子之下,可获得广谱和稳定的抗性[14]。

病程相关蛋白(PR)如几丁质酶,β-1,3-葡聚糖酶等可抗微生物活性或干扰其繁殖周期。

Brogile等将菜豆的几丁质酶基因导入烟草,获得了抗性植株[15]。

Otsuka-Chem将大豆葡聚糖酶基因导入烟草,获得了抗赤星病、根腐病等的转基因植株。

山西农业生物技术中心孙毅等将几丁质酶基因导入玉米中,获得了抗丝黑穗病菌的转基因株系。

将病原菌抗自身毒素的基因导入植物中可保护植株免受其侵袭。

现已经从烟草野火病细菌、菜豆晕斑病菌中克隆了降解相应毒素的基因ttr和argk,有望导入烟草与菜豆中获取抗性植株。