重组人生长激素背景简介一．重组生长激素的研究历史生长激素是由垂体前叶分泌的蛋白质激素，早在1886年，Pierre Marie在临床上发现肢端肥大症患者具有垂体增大的现象，1909年，Harvey Cushing 发表了关于垂体前叶控制人体生长的文章。

Evans 和Long在1921年发现牛垂体前叶的盐抽提物可以刺激正常大鼠的生长，随后Smith在1921年发现这样的提取物可以恢复垂体切除的大鼠的生长。

1944年，Li 及Evans首次从牛垂体中提取了牛生长激素。

由于牛生长激素不能促进人的生长，科学家们又尝试从人垂体中提取生长激素，并于1956年首获成功（Li and Papkoff, 1956）。

在临床试验中发现人和猴的生长激素都能促进合成代谢和身体长高（Li,1957; Raben, 1958）。

1957年至1985年，从人垂体中提取的生长激素以替代疗法用于治疗儿童的生长激素缺陷症。

这种治疗的疗效显著且没有显著的副作用，但是由于如此获得的生长激素来源有限，价格昂贵，从而限制了生长激素在其它方面的治疗应用。

随着重组DNA技术的诞生，生长激素的生产方式发生了革命性的改变，进而大大促进了生长激素的基础研究与临床应用。

1979年，Martial等首次在细菌中克隆了人生长激素的基因。

1981年，美国Genentech公司的重组人生长激素（商品名Protropin）被FDA批准进入临床试验，并于1985年正式上市。

1987年FDA批准了Elli Lilly公司的重组生长人激素产品Humatrope。

在欧洲有瑞士Serono公司生产的哺乳动物细胞表达的重组人生长激素（商品名Saizen），丹麦Novo-Nordisk公司生产的Norditropin以及瑞典的Pharmacia/Upjohn公司生产的Somatonorm和Genotropin。

国内的长春金赛药业有限公司生产的重组人生长激素于1993年获卫生部批准进入临床试验，此外还有中科院上海细胞生物学研究所、安徽生物制品研究所、珠海恒通生物工程制药公司等正在进行临床试验或中试研究。

据预测到2000年，生长激素的全球销售总额将达到10～20亿美元。

国际市场上的生长激素产品情况详见表1。

表1 国际市场上的重组人生长激素生产厂家商品名规格与剂型剂量与用法价格适应症Genentech Protropin 5或10mg,粉剂30/mg/kg/wk im/sc $210/5.0mg 生长激素缺陷导致的生长障碍Nutropin 5或10mg.粉剂30mg/kg/wk.scCRI, 0.35mg/kg/wk sc $210/5.0mg$420/10.0mgGH缺陷导致的生长障碍CRI缺陷导致的生长障碍NutropinAQ 10mg,溶液30mg/kg/wk sc $210/5.0mg GH缺陷导致的生长CRI,0.35mg/kg/wk sc $420/10.0mg 障碍CRI导致的生长障碍Tu rner’s综合症Novo Nordisk Norditropin 4或8mg,粉剂0.024-0.034mg/kg 6-7times /wk sc$168/4.0mg GH缺陷导致的生长障碍Pharmacia/U pjohn Genotropin 1.5,5.8,和13.8mg,粉剂0.16-o.24mg/kg/wk sc $63/1.5mg$210/5.8mg$504/13.8mgGH缺陷导致的生长障碍Eli Lilly Humatrope 5mg,粉剂18mg/kg/wk im/sc $210/5.0mg GH缺陷导致的生长障碍成年人GH缺陷Turner’s综合症Serono Serostim 5或6mg,粉剂>55kg,6mg/d sc45-55kg,5mg/d.sc35-45kg,4mg/d sc<35mg,0.1mg/kg/dsc$165/5.0mg d艾滋病消耗综合症Saizen 5mg,粉剂18mg/kg/wkim/sc $210/5.0mg GH缺陷导致的生长障碍CRI=慢性肾脏疾病；GH=生长激素Sc=皮下注射；im=肌肉注射Paul A Windisch et al.,The annals of pharmacotherapy, 1998, 32:437-445.二．人生长激素的结构，功能和分泌调节人生长激素由17号染色体上的生长激素基因家族中的CH-N基因编码，基因表达产物以分泌蛋白的形式由垂体前叶细胞分泌，最初表达的生长激素是一个含26个氨基酸信号肽的激素前体，在其通过粗面型内质网时信号肽被切除。

生长激素的成熟肽是一个非糖基化的单链蛋白，含有191个氨基酸，分子量为22KD，其中有四个半胱氨酸，分别形成53－165和182－189两个二硫键。

生长激素在肝脏中与其受体以高亲和力相结合，从而刺激IGF-1的产生并促进身体高度的增长。

生长激素可以刺激蛋白质合成及脂肪的利用，同时降低葡萄糖的氧化。

生长激素由垂体前叶分泌，在健康人体中，垂体每天分泌500－875μg的生长激素，在循环血中主要以生长激素单体的形式存在，生长激素和一种结合蛋白相结合形成复合物，其在血浆中的半衰期是20分钟。

GH的分泌受到多种因素的调节，包括1.下丘脑生理信号的调节，如促生长激素释放激素和生长激素抑制素；2.来自外周生理环境的信号，如IGF-I，胸腺激素，糖皮质激素和性激素等；3.外源的多肽或非多肽类的生长激素分泌促进剂，这些物质直接作用于垂体的生长激素分泌细胞或者通过激活下丘脑信号来刺激生长激素的分泌。

目前已有商品上市。

4.生理和病理状态对生长激素分泌的影响。

研究表明生长激素的分泌还随着生理和病理状态的改变而变化。

例如生长激素的分泌随年龄的增长而逐渐下降，而在节食，饥饿或患脓血症时生长激素的水平则上升。

三．重组人生长激素的生物合成由于天然人生长激素的来源有限，且无法做到成分的均一，而且来源于人垂体的生长激素由于可能传播Creutzfeldt-Jacob病而在80年代中期被最终取消，取而代之的是采用大肠杆菌或哺乳动物细胞生产的重组人生长激素。

目前的重组人生长激素分原核细胞表达和真核细胞表达两种，例如Serono公司生产的rhGH即为哺乳动物细胞表达产物。

但普遍采用的还是大肠杆菌表达的rhGH，大肠杆菌表达的rhGH又分为两种，即与天然生长激素序列一致的表达产物如Humatrope、Genotrope 和Saizen等，以及第一个氨基酸为甲硫氨酸的表达产物，如Protropin，Somatonorm和Norditropin 等。

其中含甲硫氨酸的生长激素在人体内能够产生抗体，但并不影响其生物活性。

所有的重组生长激素都表现出相同的疗效和药代动力学特性。

目前重组人生长激素的剂量以mg/kg/day，或mg/kg/week，或IU/kg，或IU/m2/day或IU/m2/week来表示。

其中IU为生长激素的国际单位，1 IU ＝2.7 mg人生长激素。

四．大肠杆菌表达的重组人生长激素的纯化方法1．直接在胞内表达具有生物活性的重组人生长激素的纯化根据Shingo Niimi 等文章中提到的方法：先将菌体超声破碎，上清液经盐析分步沉淀，把含重组人生长激素的蛋白沉淀搜集、重新溶解，经离子交换层析、等点聚焦层析和分子筛柱层析，最后得到高纯度的重组人生长激素（7.13 mg rhGH/10 g·cell）。

经免疫和活性检测，结果与天然人生长激素一致。

文中还提到类似的方法，菌体抽提物经盐析，阴、阳离子柱层析和S-200后，或用单抗吸附，在经离子交换层析，均得到高纯度重组人生长激素；但因后者未提到收率,二者无法比较优劣。

2．以包涵体形式存在的重组人生长激素的纯化由于上游构建的高效表达质粒并未十分成功，目前的表达水平在15%左右（占总菌体蛋白含量）。

Timothy E. Adams在1992年设计出一种一步纯化的方法：作者首先构建一个表达后不带有蛋氨酸的质粒，发酵表达后将包涵体离心、沉淀，用5M尿素冲洗去除杂蛋白，再溶于含阳离子表面活性剂十六烷基三甲基季胺氯化物的溶液中，经离子交换树脂除去十六烷基三甲基季胺氯化物，在含有氨基乙醇的溶液中透析复性24～36小时得到相当于包涵体20%的重组人生长激素蛋白；经RP-HPLC一步纯化得到95%纯度以上重组人生长激素。

色谱条件为：A.水（0.1% TFR），B.乙腈（0.1% TFR）两者组成梯度洗脱液，在乙腈浓度为65%时洗脱出重组人生长激素。

1995年，Reema Mukhija 等提出一种新颖的纯化方法。

作者通过基因工程构建一种表达后N端连有6个组氨酸的特异重组人生长激素，据此建立了一种亲和层析的纯化手段：由于6个组氨酸可以特异吸附在含Ni2+ nitrilotriacetic acid的亲和层析柱上，用咪唑单一洗脱重组人生长激素，进而得到纯品。

进一步研究表明，该蛋白几乎不产生因组氨酸带来的免疫抗性，对生物活性也无任何影响。

3．分泌表达的重组人生长激素的纯化分泌表达因其提取方便，无须复性的优点，已被广泛采用。

这种技术在重组人生长激素上的应用也十分成功。

国外在1989年就有此种类型的重组人生长激素商品（Genotropin ）问世。

因分泌型蛋白的特点是将重组蛋白分泌到胞膜与胞壁之间，所以采用一种“渗透度（osmotic shock）”的方法可方便提取。

现简要介绍一下：将发酵液离心后，沉淀放置冰上，以下所执行步骤均在4℃左右进行，沉淀悬浮含20%蔗糖的缓冲液中0℃保持10分钟，再次离心，沉淀悬浮低浓度缓冲液中保持10分钟，离心后上清液中即含有重组蛋白。

然后将蛋白液进行盐析、离子交换和分子筛层析，得到高纯度重组人生长激素。

整个过程重组蛋白可浓缩15倍，最终收率为71%。

五. 重组人生长激素的临床应用随着对生长激素的生理学，药理学作用的日益清楚，特别是生长激素-IGF-1生理轴线研究的进展，利用重组DNA技术生产的重组人生长激素在临床治疗的应用也日益广泛，目前FDA除最早批准的应用于儿童生长激素缺陷治疗的适应症外，还批准了生长激素用于儿童晚期肾病相关的发育不良，成人生长激素缺陷，成人HIV消耗综合症等，此外还有多种临床适应症正在进行临床试验，见表2。

这显示出生长激素作为人体最重要的激素之一在临床中的应用前景是非常广阔的。

表2 重组人生长激素临床应用一览表FDA已批准的临床适应症正在做临床试验的适应症潜在的临床适应症儿童生长激素缺陷1985 儿童肾脏或肝脏移植受体患者正常儿童的生长延迟儿童晚期肾病子宫内发育延缓延缓衰老成人生长激素缺陷1996 Noonan 综合症骨质疏松症Down 综合症Prader-Willi 综合症AchondroplasiaSpina bifida成人HIV 消耗综合症1996 重症病人成人Dilated cardiomyopathyX 综合症IGFII 分泌性肿瘤引起的低血糖症Short Bowel 综合症不育症Nicholas A. Tritos et al, The American Journal of Medicine 1998, 105:44-571．重组人生长激素在儿童中的临床应用1）生长激素缺陷综合症生长激素缺陷的儿童是生长激素首先被批准用于临床的适应症，其主要原理是用外源的生长激素对生长激素内分泌缺陷进行替代治疗。