平板倒置
恒温培养箱
划线分离法
（5）斜面接种保存
• 在无菌操作下将单菌落用接种环取出， 再用划线法接种在斜面上。
• 37℃培养24h后，4 ℃冰箱保存。
涂布分离法
首先，涂布分离法的操作比划线分离法 更复杂。因为涂布分离法包括先将菌 液稀释的步骤，而且通常要稀释多个 浓度，常稀释到10-5-10-7倍。（稀释实 验过程见P26图）在涂布时，从不同稀 释度的稀释菌液中各取0.1ml放在平板 固体培养基上，再用玻璃刮刀涂布后 培养。
部份致病微生物的过程。）
（2）倒平板
• 灭菌后，待灭菌锅压力与大气压力相 同时打开锅盖 • 将有培养基的三角瓶和培养皿放到超 净台上 • 打开超净台的紫外灯和过滤风，待固 体培养基冷却到60℃时，关闭紫外灯 •用酒精棉球消毒桌面和手。
倒平板： 10-12ml培养基/培养皿 每倒入一个后立即置于水平位置上， 轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部， 待凝，并形成平面。
用脱脂棉：易吸水引起后引起污染），也可采用各
种金属、塑料、封口膜及硅胶帽，它们只可让空气
通过，而空气中的其他微生物不能通过。
• 高压蒸汽灭菌法：玻璃器皿、金属、移液 枪头等
• （火焰）灼烧：接种环、试管口、三角烧 瓶口
• 紫外灯+过滤风：超净台灭菌
• 消毒：70%酒精棉球
（消毒：利用化学或物理方法，杀死大
• 将培养皿倒置（盖在下面），放到恒温培养箱 中培养12-24h后，可看到在划线的末端出现 不连续的单个菌落，表明菌已被分离。
划线分离法
• 划线的起点要有菌，且每一次新的起点应 比前一次的起点菌含量（浓度）低
• 划线的最终点不能与前面的划线点重叠
除第1次外，其余几次划线前，都要将 接种环火焰灼烧
防止培养皿盖上的冷凝水滴落入培养 基表面，使菌落中的菌随水扩散，造 成污染。
置于灭菌锅内1kg压力灭菌15min （121℃）
无菌技术
最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭
所有的生物，同时可以基本保持培养基的营养成分
不被破坏。
（160 ℃ 2h或170 ℃ 1h）
有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为防止
杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶
都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞（不能
脱色
革兰氏染色法
结晶紫 1min 碘液 1min 95%乙醇
复染
革兰阳性
革兰阴性
菌落（colony）：一个细菌细胞在 固体培养基上发展成一个肉眼可见 ，具一定形态结构的子细胞群。
光滑型菌落
粗糙型菌落
二、细菌的培养和分离
1、实验仪器设备：
移液枪接种环Leabharlann 玻璃刮刀超净工作台
（保证 无菌环境）
高压蒸汽灭菌锅
• 右手：拿接种环，并用无名指和小指 夹住斜面的棉塞和三角瓶的封口膜；
• 接种环在火焰上烧红，再深入到斜面， 使环接触培养基，再取菌体；
• 将菌体放入三角瓶的液体培养基中， 瓶口封口膜和管口棉塞复原；
• 将三角瓶置于37℃摇床振荡培养12h。
（4）划线分离
• 在酒精灯火焰上灼烧接种环；
• 将摇床上培养了12h的菌液 打 开，接种环部分深入到菌液中； • 在固体培养基的平板上连续划线，接种环只 在菌液中蘸菌液一次，划线后盖好培养皿；
酒精灯旁：
左手？右手？
制作试管斜面： P21小字部分
• 将配制好的呈熔化状态的培养基 转移到试管中时必须用三角漏斗
• 将分装好的含培养基的试管灭菌
• 灭菌试管冷却到50℃左右， 把试管棉塞一端搁在玻棒上， 待冷凝后即成试管斜面
棉塞制作
正确
1/3在试管外，
2/3在试管内
不正确
（3）接种培养
• 左手：将大肠杆菌斜面和有液体培养基 的三角烧瓶，靠近酒精灯火焰；
其次，涂布分离法更易分开单菌落。通 常培养皿中有20个以内的单菌落为最 合适。
土 样 稀 释
实验大肠杆菌的分离和培养
第一部分 微生物的利用
微生物：是指结构简单、形体微小的单细胞、 多细胞或没有细胞结构的低等生物，如酵母 菌、细菌、放线菌、霉菌、蓝细菌和病毒等。
绝大多数微生物与传染病无关，90%以上的 微生物是对人类有益的。
微生物有多种用途，许多抗生素来源于放线 菌和霉菌；有些食品由微生物发酵制成，如 酒由酵母发酵产生，腐乳由红曲霉和毛霉发 酵制成。
实验1 大肠杆菌的培养和分离
• 基本要求 • 1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培
养基进行细菌培养的操作。 • 2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面
培养基进行细菌的培养。
一、大肠杆菌
• 革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌
• 在肠道中一般对人无害
• 但也有一些菌株对人体是有害的，可侵袭 肠粘膜并产生毒素
• 任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都 会对人体产生危害。
恒温培养箱
摇床
2、培养基：液
固体培养基体
培 养 基
LB培养基：
固
蛋白胨：0.5g
体
酵母提取物：0.25g 培
NaCl:0.5g
养
H2O:50mL 琼脂：1g
调pH值
基
平板
斜面
液体培养基（培养液）
菌膜
对照
菌沉淀
均匀浑浊
3、实验步骤：
（1）培养基、培养皿灭菌 ——高压蒸汽灭菌法
• 将配制好的50ml LB液体和固体培养基 分别装入250ml 三角瓶中，加上封口膜； • 将培养皿用牛皮纸包好；