库，成功获得了4株能与角蛋白特异性结合 的人源性抗角蛋白IgG或IgM抗体；对抗体 基因的随机突变未产生预期的性能改进， 又选择其中活性最好的一株IgG抗体，通过 轻链替换和重链替换使抗体亲和力得到了 有效提高．达到8×lO10／M的理想水平。
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①．随机突变： ：将带有亲本抗体基因 的质粒用氯化钙转化法转化到高突变菌株 XL1-Red感受态细胞进行随机突变。在 200 mL含有氨苄西林的SB培养液中26℃ 振荡培养24 h作为一轮，然后取出5 mL扩 大到200 mL体积进入下一轮．共进行16 轮培养；将最后一轮的菌液离心。收获沉 淀提取质粒并用电穿孔法转化到TG1菌株 ．扩大培养的细菌用辅助噬菌体VCSM13 诱导表达噬菌体抗体，回收突变抗体库以 备筛选用。
方法 ：以人表皮角蛋白为抗原，从噬菌
体抗体库中克隆特异性抗角蛋白抗体，采 用基因随机点突变和链替换(chain shuffling)技术对所获抗体进行亲和力成 熟，并对其生物学性能进行一系列鉴定。
1.抗角蛋白抗体的克隆
①.抗体库的筛选：对噬菌体抗体库进行 扩增，获得抗体库上清滴度为1～ 1.3×1014 cfu／mL；以人表皮角蛋白为 抗原，先后对半合成抗体库和天然抗体 库进行“亲和吸附一洗脱一扩增”筛选， 以克隆人源性抗角蛋白抗体。
②．链替换：将亲本克隆的重链与K轻链库 的多样性轻链组合形成轻链替换库，用解 离速率筛选法选取亲和力高于亲本的克隆 ；然后进行重链替换。将轻链替换后亲和 力提高的克隆与多样性Fd段基因随机组合 构建重链替换库．用同样的方法淘筛选取 亲和力进一步提高的克隆．最终得到高亲 和力抗角蛋白抗体。
③．亲和力测定：在筛选过程中用硫氰酸盐 洗脱法测定获得抗体的相对亲和力，从中 选出亲和力最佳者，再用非竞争酶免疫法 测定其亲和指数。
②.噬菌体抗体的ELISA鉴定： 选择以1．25 Ixg／mL浓度的人表皮角 蛋白包被酶标板，经1％BSA封闭后加 入待测噬菌体抗体上清液，以HRP一 羊抗M13为二抗，孵育、洗涤后OPD 底物显色。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2.提高抗体亲和力
为了获得高亲和力的抗角蛋白抗体， 我们从筛选到的抗体中选择活性最好的1株 作为亲本，用基因随机突变和链替换两种 手段对其亲和力进行改造。
3. 抗体鉴定
• 特异性：用ELISA方法鉴定抗体与抗原结
合的特异性，所用无关抗原有胃蛋白酶、 木瓜蛋白酶、铁蛋白等，实验操作按常规 方法进行。
• 抗体可变区基因测序：对所获高亲和力
抗体进行可变区基因序列测定，登录基因 库(GenBank)对测序结果进行分析。
• 结果：经过筛选半合成抗体库和天然抗体
（一） 操 作 方 法
从免疫后个体制备人
源抗体
<一>、概念
对于能进行体内免疫的抗原， 从被免疫者获取淋巴细胞构建抗体 库，可以较容易地得到高亲和力的 抗体，主要包括疫苗注射、微生物 感染、自身免疫疾病、肿瘤等。目 前已经有很多关于人源抗体制备的 报道。
但由于这些抗体库的构建取 材于体内免疫者的淋巴细胞，在体 内经过抗原选择和亲和力成熟，因 此从较小库容（105~107）的抗体 库就能较容易地筛选到特异性强的 高亲和力抗体。
<二>、高亲和力抗角蛋白人抗体 的基因工程制备
目的：制备亲和力高、性能良好的人源性 抗角蛋白抗体。
材料：半合成噬菌体抗体库和人源性 天然抗体库。库容分别为4×108和 1×109；大肠杆菌菌株TG1、辅助噬菌 体VCSM13；高突变菌株XL1-Red；各 种内切酶，T4 DNA连接酶，Taq DNA 聚合酶；混合分子量人表皮角蛋白(5 mg／mL)和人血清IgG型抗角蛋白自身 抗体(IgG—AK auto Ab)