利用微生物控制蓝藻水华的研究方法
摘要：随着人口的快速增长以及社会经济迅猛发展导致化肥的使用量急剧增加，再加上含磷洗衣粉的大量使用，未经处理的富含N、P的生活污水和农业上未被利用的N、P等大量排入内陆水体，使全球范围内的水体富营养化现象日趋严重。

形成水华的藻类（主要是蓝藻）的大量繁殖正是水体富营养化的重要表征之一。

为了控制水华现象的发生，人们尝试了很多种方法，本文主要是针对利用有效细菌控制水华的方法进行阐述。

关键词：蓝藻；水华；微生物；富营养化
由于人工固氮产生的氮肥及开采出的磷矿制成的磷肥集中使用在陆地生态系统，再加上含磷洗衣粉的大量使用，未经处理的N、P的生活污水的排放。

导致水体中的氮磷含量提高，造成藻类的大量繁殖形成的水华现象。

其中蓝藻水华的发生范围最广。

蓝藻水华主要出现在淡水水体，如湖泊、河流和水库等。

由于蓝藻在水体表面大量堆积，不仅影响水体景观，而且如果这样的水体被用作饮用水源，会给自来水处理及水源的安全带来危害，因为蓝藻能够产生各种各样的天然毒素。

目前，治理蓝藻水华污染有物理、化学、生物等多种方法。

物理方法主要采用底泥疏浚、饮水冲洗等；化学方法有投加混凝剂和除藻剂等。

虽然物理化学方法有见效快等优点，但往往存在成本高、副作用大和效果不能持续等缺点，因此不能长期持续控制蓝藻水华的爆发。

与之相比，生物学的方法短期效果不显著，但具有成本低、不带来污染和治理效果持续等优点，是采用生态学方法治理蓝藻水华污染生态学问题的发展方向的研究热点。

微生物因其生长速度快，代谢途径多的特点成为治理蓝藻水华的污染的先锋。

1.溶藻微生物的获得方法
1.1 获得溶藻微生物的可行性方法
1.1.1 原位取样分离即在有害藻华爆发水域待有害藻类衰退时或衰退后即时取样,送回实验室进行分离鉴定。

1.1.2 异位取样分离即在有害藻华爆发水域外其它水域取样,送回实验室进行分离鉴定。

这种方法目前应用比较广泛。

如彭超等从武汉市的4个池塘采回14批水样,成功地分离到3株溶藻细菌,它们分别能溶解中国科学院水生生物研究所藻种保藏中心提供的念珠藻、鱼腥藻、铜绿微囊藻、鞘丝藻等多种蓝藻。

1.1.3 生物工程手段即利用现代生物技术(基因工程)构建溶解某种有害藻类的工程菌株。

这种方法虽然目前还没有见到报道,但是在植物病害和虫害生物防治中早已有相关报道,并且有的已得到广泛应用。

因此,随着现代生物技术的日益发展,生物工程菌必将成为溶藻微生物的重要组成部分。

其中，原味取样分离和异位取样分离方法比较简单，但是工作量大、随机性强。

生物工程手段的选择性强，但要求工作人员掌握较强的生物技术，而且费用比较昂贵。

2.溶藻微生物的纯化
溶藻微生物分离以后，由于微生物的种类较多，包括细菌、真菌、放线菌等，对于不同种类的微生物,我们应该对其进行纯化,以期望得到纯种。

2.1细菌的纯化方法
分离培养后,我们可根据细菌菌落特征来判断分离效果如何。

如果菌落的类型很多,且分不清主次,则很可能没有分离到目标细菌,或即便存在目标细菌,也早已与它菌混杂。

如果认为分离效果很差,应考虑重新分离。

如果分离结果较好,则琼胶平板上菌落的形状和大小比较一致,即使出现几种不同形状的菌落,总有一种是主要的。

如果我们不熟悉目标细菌菌落的特征,应该选择几种不同类型的菌落,分别培养后回接供试藻种,来判断目标细菌。

2.1.1单孢培养纯化法无菌操作挑取目标细菌菌落少许,在琼胶平板表面划线形成单孢可得到纯种。

另外一种方法是配制目标细菌的悬浮液,通过稀释培养而得到单孢纯种。

2.1.2 过滤法选择一定孔径的滤膜过滤目标细菌悬浮液得到纯培养的方法。

2.1.3 显微操作器分离纯化法显微操作器实质上是一种“机械手”,代替手来作各种显微镜下的操作。

由于细菌很小,所需的琼胶培养基要洁净才能看清和挑到细菌。

2.2 真菌的纯化方法
真菌分离时,一般都是从形成的菌落边缘挑取菌丝体进行移植培养,这本身就有一定的纯化作用。

另一方面,从菌落的培养性状或显微镜检查可以发现是否混有杂菌。

2.2.1 单孢培养纯化法同细菌的纯化方法。

2.2.2 过滤法同细菌的纯化方法。

2.2.3 显微操作器分离纯化法同细菌的纯化方法。

2.3放线菌的纯化方法
放线菌的纯化方法与一般细菌相似,即挑取单个分离到的菌落,配制成孢子或捣碎的菌丝体的悬浮液,在琼胶平板上稀释或划线培养。

可用一般分离培养基纯化,但是挑取到的单个菌落要在不加抗菌素或其它抑菌物质的培养基上培养来验证纯化的菌种是否污染真菌和细菌。

3.溶藻微生物的溶藻试验
3.1 液体溶藻试验
按照每30mL藻液加3mL菌液的方式进行,设空白对照。

定时在显微镜下观察,并隔天测量其叶绿素含量。

菌液选择不同的浓度梯度进行试验。

3.2 固体溶藻试验
取浓缩过的藻液2mL用固体培养基(BG11+1%琼脂)培养,置于光照培养
箱内培养4d,再按不同浓度接入溶藻微生物,观察其溶藻现象。

3.3 水槽溶藻试验
取一组6个相同规格(30×30×70cm3)的玻璃水槽,置于室外。

从集藻区取水样加入玻璃水槽中(每格水槽的水样均为36L),按不同浓度接入溶藻微生物,并定时搅动水样。

试验过程中不定期观察、拍摄试验现象,显微镜下观察藻细胞的形态特征变化;定期测定水体的叶绿素含量。

4.溶藻微生物溶藻效果的测定
4.1 液体溶藻效果
4.1.1藻液颜色变化连续定时观察并记录加菌藻液和空白对照颜色,通过比较二者颜色变化来初步判定供试微生物的溶藻效果。

4.1.2显微镜观察藻细胞的形态特征变化连续定时观察并记录加菌藻液和空白对照藻细胞的形态特征变化,如是否发生破碎等可判定供试微生物的溶藻效果
4.1.3叶绿素含量测定藻类叶绿素a含量可作为生物量的重要指标,通过连续定时观察并记录加菌藻液和空白对照叶绿素a含量变化来判定供试微生物的溶藻效果。

4.1.4光合效能测定用便携式植物效率分析仪测定叶绿素荧光。

用可变荧光和最大荧光的比值表示光合效能活性的大小。

4.1.5丙二醛含量测定丙二醛作为脂质过氧化指标表示藻类细胞膜脂过氧化程度和对加入菌液后反应的强弱,通过连续定时对其进行测定的结果来判定供试细菌的溶藻效果。

若藻液黄化、藻细胞发生破碎、叶绿素含量下降、光合效能降低以及丙二醛含量增高等,均说明供试微生物具有溶藻能力。

4.2 固体溶藻效果
4.2.1藻平板表面是否出现溶藻斑溶藻斑的出现,是溶藻微生物发挥溶藻效果的重要标志。

4.2.2藻平板表面颜色变化观察加菌和空白对照的颜色变化来初步判定供试微生物的溶藻效果。

4.2.3显微镜观察藻细胞的形态特征变化观察加菌和空白对照藻细胞的形态特征变化,如是否发生破碎等可判定供试微生物的溶藻效果。

若藻平板表面上出现溶藻斑、藻平板表面黄化以及藻细胞发生破碎等,均说明供试微生物具有溶藻能力。

5.溶藻方式
5.1 液体培养溶藻方式对菌液用微孔滤膜(孔径应小于溶藻细菌)过滤,取滤液,进行平板培养,若平板培养后无活菌生长,说明滤液合格,则重复上述溶藻试验。

若溶藻微生物滤液没有明显的溶藻现象,而溶藻微生物培养液溶藻现象明显,说明供试溶藻微生物可能是通过直接接触溶解藻细胞或者是与藻细胞
竞争有限的营养物质而使藻细胞死亡;若溶藻细菌滤液具有明显的溶藻现象,说明供试溶藻微生物可能是通过释放某种物质进行溶藻。

5.2 固体培养溶藻方式显微镜观察微生物菌体与藻细胞之间的关系。

若菌体附在藻细胞上,且该藻细胞周围已出现细胞碎片,则可推测是由于微生物直接侵入藻细胞导致其发生破碎。

若菌体和藻细胞处于分离状态,则可能是由于微生物通过释放某种物质进行溶藻,应进一步对该物质进行分离提纯等加以确定。

6.讨论
利用微生物控制蓝藻水华有很好的研究前景，微生物可以简单有效的控制藻类的生长，而且不会对水体环境造成较大的危害，是一种简单有效的治理蓝藻水华的方法。

如果能够较好的利用，肯定会对蓝藻水华的治理有很大的贡献。

参考文献：
1.谢平，论蓝藻水华的发生机制
2.陈建、丛君等，利用有效微生物菌群控制蓝藻水华研究
3.安鑫龙，李豫红等，溶藻微生物的研究方法
4.丁西明、傅以钢等，溶藻系统中微生物的群落结构研究
5.史顺玉，刘永定等，细菌溶藻的初步研究。