2010年6月第25卷第6期中国粮油学报JournaloftheChineseCerealsandOilsAssociationVol.25,No.6Jun.2010
煎炸油及其加热产生的极性物质致突变性研究刘元法 穆 昭 单 良 范柳萍 王兴国(江南大学食品学院,无锡 214122)
摘 要 煎炸过程中,煎炸油发生了氧化、水解、聚合等反应发生,导致煎炸油中的极性物质含量升高。通过Ames试验和骨髓微核率试验对煎炸油及煎炸油中的极性物质的致突变性进行研究。在不加S9时,煎炸油中分离出的极性物质对鼠伤寒沙门氏菌TA100的致基因突变作用并存在剂量反应关系y=14.992e
0.27x
,煎
炸后煎炸油、加热后煎炸油以及极性物质对TA102都存在剂量反应关系分别为y=100.97e0.0736x、y=84.992e0.0936x、y=129.65e0.0567x,在加入S9后各试验组对TA97、TA100、TA102都存在剂量反应关系。极性物质导致小鼠骨髓多染红细胞的微核率升高,其中高剂量组(17.44±0.43)‰,并呈剂量反应关系y=3.4553lnx+
22.979。煎炸油及其极性成分具有致突变作用。关键词 煎炸油 极性物质 致突变性Ames试验骨髓微核率中图分类号:TS225 文献标识码:A 文章编号:1003-0174(2010)06-0051-05
基金项目:国家科技支撑计划(2009BADB9B07)收稿日期:2009-05-11
作者简介:刘元法,男,1974年出生,副教授,食用脂质产品的加工技术与深度开发
在煎炸过程中,煎炸油长时间处于高温、与氧气接触导致煎炸油中的甘油三酯发生氧化反应,产生氧化产物,醛、酮、酸以及烃类,同时,煎炸食品带入体系的水在高温催化下,导致煎炸油中的甘油三酯水解,产生游离脂肪酸等。另外,多双键脂肪酸的分子容易聚合,聚合有两种形式即热聚合和氧化聚合[1]。这些氧化、水解、聚合等反应产物,即为煎炸油中的极性物质,在煎炸过程中煎炸油的极性物质含量随煎炸时间而增加,同时煎炸油中对健康有害的成分含量增加,导致基因突变、染色体突变从而诱发癌症如乳腺癌、结肠癌等[2-3]。人体在致突变物质即诱变剂的作用下可产生两种严重的后果,其一是致突变原可引发人类生殖细胞遗传物质的突变,导致下一代遗传性疾病发病率的升高,其二是致突变原引发的人体细胞遗传物质的突变可导致各种紊乱,其中最严重的后果是肿瘤或癌症的发生。从遗传毒理学角度讲突变主要分为两大类:基因突变和染色体畸变。基因突变可以通过Ames试验进行检验,即利用是否能引起鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型(hisˉ)菌株的回复突变来判断化学物质是否为诱变剂和致癌剂,并能区别突变的类型(置换或移码突变)[4]。微核率可以体现受试物是否导致染色体突变(在染色体断裂剂的作用下,均能产生微核)[5]。国内外对于煎炸油使用后对人体的影响逐渐开始研究,Lin等[6]对每日食用煎炸油对大鼠的自身免疫系统的影响进行了研究,周纯先等[7]和沈玲玲等[8]研究了反复煎炸油的致突变性和油脂煎炸后对动物的影响,认为煎炸油在煎炸后对动物自身免疫和致突变性都有明显影响。从研究文献来看,国内外对煎炸油对人体健康研究相对较少,研究主要针对油本身的变化和对人体的影响,对其中有害物质的研究未见相关报道,通过Ames试验和骨髓微核率试验来研究煎炸油及其极性物质的致突变性,进一步明确煎炸油在使用后对人体的影响和关键影响因子对于食品安全研究和控制具有积极的作用。
1 材料与方法1.1 主要原料和试剂组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA100、TA102:上海市疾病控制中心;3只大鼠:浙江省动物实验中心;昆明小鼠140只:浙江省动物实验中心。二甲基亚砜、环磷酰胺、苯巴比妥钠、β-萘黄酮、NADP、G-6-P、L组氨酸、生物素、甘油三酯测定试剂盒:温州津玛生物有限公司;总胆固醇测定试剂盒:温州津玛生物有限公司;超氧化物歧化酶测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶测试盒、丙二醛测定试剂盒:南京建成科技有限公司。中国粮油学报2010年第6期1.2 试验仪器HRM-242ⅡP高压杀菌锅:华粤行仪器有限公司;MJL-8A煎炸锅:上海来尔佳餐饮管理有限公司;BT-1600图像颗粒分析系统:丹东市百特仪器有限公司。
2 试验方法2.1 受试物质的制备煎炸后煎炸油:煎炸油在180℃温度下煎炸鸡腿,每批5只,每小时一批,直至煎炸油中的极性物质含量达到25%(极性物质含量检测采用硅胶柱层析AOCS方法)。加热后煎炸油:煎炸油在180℃温度下于油浴锅中加热,直至煎炸油中的极性物质含量达到25%(极性物质含量检测采用硅胶柱层析AOCS方法)。煎炸后煎炸油中极性物质:采用上面方法制备煎炸后煎炸油,然后采用硅胶柱分离出其中的极性成分。首先用石油醚:乙醚87
:
13(V/V)的洗脱液进
行洗脱,将吸附在硅胶柱中的煎炸油中非极性物质洗脱下来,然后用乙醚将极性物质洗脱下来,旋转蒸发溶剂,得到煎炸后煎炸油中的极性物质。在Ames试验中将上述各受试物溶解在二甲基亚砜中,质量浓度分别为50、20、5mg/mL(根据Ames
试验受试物剂量5、2、0.5mg/皿,添加量:100μI)。2.2 代谢活化系统S-9的制备成年雄性大白鼠3只(体重300g左右),称重,
灌胃80mg/kg苯巴比妥钠和80mg/kgβ-萘黄酮连续3d,杀前大鼠禁食16h,取3只大白鼠的肝脏合并后称重,用0.15mol/LKCl溶液洗涤3次,剪碎,每克肝脏(湿重)加3mL0.15mol/LKCl溶液,制成匀浆,离心(9000r/min),取上清液(即S-9)分装小试管,每管1～2mL,液氮速冻,-20℃冷藏备用。所用器皿、刀剪、溶液都需保持无菌,并在0～4℃下(也可在冰浴中)操作。
每100mLNADP和G-6-P使用液含NADP
297mg,G-6-P152mg,0.2mol/LpH7.4的磷酸缓冲液50mL(Na2HPO4・12H
2O7.16g,KH2PO42.72g,
加水至100mL,灭菌后备用),盐溶液2mL(MgCl
2
8.1g、KCl12.3g加水至100mL,灭菌后备用),加水
至100mL。细菌过滤器过滤除菌,经无菌试验后分装成每瓶10mL的小瓶,-20℃储存备用。取2mLS-9加入10mLNADP和G-6-P使
用液(将低温贮存S-9和使用也室温下融化后现配现用),混合液置冰浴中,用后多余部分弃去。2.3 菌株的增菌培养菌株组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA100、TA102,增菌培养用牛肉膏蛋白胨液体培养基,接种后于37℃,100r/min振荡培养12h左右,
含菌数应为1×109个/mL～2×109个/mL。(由于紫外线对组氨酸营养缺陷型鼠沙门氏菌具有紫外线修复作用,因此培养过程要避免光照)。2.4 菌株鉴定用于测试的菌株,需经基因型和生物学性状鉴定,符合要求才能投入使用。(1)脂多糖屏障丢失(rfa);(2)R因子划线接
种,贴放滤纸条浸湿的药液为氨苄青霉素钠溶液。TA102除pKM101外,还有pAQ1,载有抗四环素的基因,故另用滤纸条浸湿四环素溶液后贴放于划线接种的平板上;(3)紫外线损伤修复缺陷(△uvrB)鉴定;(4)自发回变鉴定;(5)回变特性———诊断性试验上层软琼脂中除菌液外,还注入已知阳性物之溶液(环磷酰胺),需活化系统者并加入S9,其他同上。
2.5 Ames试验受试菌株:TA97、TA100、TA102。溶剂:二甲基亚砜(受试物溶解在溶剂中,浓度根据剂量不同而变化)。阳性组:环磷酰胺。阴性组:二甲基亚砜。剂量:5mg/皿、2mg/皿、0.5mg/皿。试验采用平板渗入的方法,将含组氨酸生物素溶液的顶层培养基2.0mL分装于试管中,45℃水浴中保温,然后每管依次加入试验菌株增菌液0.1mL,
受试物溶液0.1mL和S90.5mL(需代谢活化时),
充分混匀,迅速倾入底层琼脂平板上,转动平板,使之分布均匀。水平放置待冷凝固化后,倒置于37℃培养箱里48h,计数每皿回变菌落数。试验除设受试物个剂量组外,同时设空白对照(自发突变)、溶剂对照(二甲基亚砜)、阳性对照(环
磷酰胺),每个剂量做三个平行皿。2.6 骨髓微核率试验70只小鼠雌雄各半,雌雄各随机分组每组5只,分为7个组。小鼠预饲养3d,体重22g左右,其中第一组为阴性组,灌生理盐水0.2mL/只,第二组阳性组环磷酰胺,剂量50mg/kg体重,第三组极性成分剂量0.2mL/只,第四组极性成分0.1mL/只,第五组极性成分0.05mL/只,第六组煎炸后煎炸油剂量0.2mL/只,第七组加热后煎炸油0.2mL/只。小鼠预饲养3d,连续灌胃7d,第7天禁食24h后,称体
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