Advances in Microbiology 微生物前沿, 2015, 4, 20-25 Published Online March 2015 in Hans. http://www.hanspub.org/journal/amb http://dx.doi.org/10.12677/amb.2015.41004
20 Preliminary Discussion on Problems of Rhizobium Inoculants
Jianfeng Li1,2, Shuqing Zhang1,2*, Jianxiong Du3, Han Han1, Lili Zhang1 1Key Laboratory of Guizhou Bioresource Development and Utilization/Institute of Soil and Environment
Bioremediation in Karst Habitats, Guizhou Normal College, Guiyang Guizhou 2Key Laboratory of Grassland Ecosystem of Ministry of Education, Gansu Agricultural University, Lanzhou Gansu
3Guizhou University of Finance and Economics, Guiyang Guizhou
Email: *smartclover@foxmail.com
Received: Feb. 26th, 2015; accepted: Mar. 8th, 2015; published: Mar. 11th, 2015 Copyright © 2015 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Abstract Rhizobium is found excellent in promoting growth and yield of legume crops, which decreases the cost of agricultural production and the side effect of chemical fertilizer application. Currently, Rhizobium inoculants have not been widely used in agriculture. Currently, the practical applica-tions of Rhizobium are restricted by quality factors of some inoculants. In this paper, we discussed briefly the factors such as low strain breeding efficiency of Rhizobium, serious contamination and short shelf life of inoculants, to provide some reference to the further research and application of commercial Rhizobium inoculants.
Keywords Rhizobium, Commercial Inoculants, Contamination, Product Quality
根瘤菌剂现存问题初探 李剑峰1,2，张淑卿1,2*，杜建雄3，韩 晗1，张丽丽1 1贵州师范学院，贵州省生物资源开发利用特色重点实验室，喀斯特生境土壤与环境生物修复研究所，贵州
贵阳 2甘肃农业大学，草业生态系统教育部重点实验室，甘肃 兰州
3贵州财经大学，贵州 贵阳
Email: *smartclover@foxmail.com
*通讯作者。 根瘤菌剂现存问题初探 21 收稿日期：2015年2月26日；录用日期：2015年3月8日；发布日期：2015年3月11日
摘 要 根瘤菌有促进豆科作物生长及产量的作用，能减少施用化肥带来的副作用并降低农业生产的成本。目前，根瘤菌的实际应用受到部分菌剂产品质量因素的限制。本文就商用根瘤菌剂应用中遇到的菌种选育效率低、菌剂污染率高、有效期短等问题予以探讨，为根瘤菌剂的深入研究和应用提供一些参考。
关键词 根瘤菌，商用菌剂，污染，产品质量
1. 引言 菌剂类肥料通常指以菌种活体及其代谢物改善植物营养条件，对植物的生长、发育或有效成分有促进作用的一类特殊生物制品[1]。根瘤菌剂作为应用时间最长、最为广泛的菌剂类产品，对于减少化肥施用量、提高豆科作物的品质有良好的作用。但目前，根瘤菌剂在国内的发展和应用也面临着一些问题。许多菌剂产品在实验室的栽培试验中促生能力表现突出，但经过规模化生产、包装，经历货架期进入田间施用应用时，增产效果却不能达到预期的效果。一方面菌种退化会导致结瘤能力下降，另一方面一些根瘤菌剂在使用说明或包装上未对菌种的互接种族特性进行明确的描述，所含菌种无法侵染非互接族的豆科作物形成根瘤[2]。更重要的是菌种的选育和菌剂制备过程缺乏谨慎的验证和优化，一些未经验证的外源营养或功能性添加剂对菌种自身的性状有一定的影响，甚至可能诱发菌种变异，加速菌种退化。经初步调查，市售菌剂中仅有少数产品的菌种经过正规的申报鉴定程序，而一些不具备研发和质量监控能力的厂家在生产中并不重视菌种的更新选育和生产环境的洁净度控制。这就导致市场上的根瘤菌剂类目繁多，但品质良莠不齐，肥效的不确定性让使用者望而却步。本文就长期以来商用根瘤菌剂存在的一些问题进行归纳，旨在为根瘤菌剂的生产和发展提供一些参考。
2. 根瘤菌剂存在的主要问题 商用根瘤菌剂产品能否能够顺利的走向市场，分别基于下列因素：(1) 根瘤菌剂产品实际增产效果[3]；(2) 产品的生产成本；(3) 根瘤菌剂的有效活菌数和菌剂有效期[4]；根据国内外根瘤菌剂近一个世纪的生产和应用，商用的根瘤菌剂产品面临的主要问题包括：(1) 商用菌剂中活菌数目不足；(2) 根瘤菌剂的污染率高且有效期过短[5]；(3) 在长期种植豆科作物的地区，部分菌剂的占瘤率过低，菌剂产品缺乏相应的详细说明书对施用方法进行指导；(4) 菌剂中菌种肥效单一，缺乏竞争力；(5) 其他如产品施用配套技术、施用条件及产品知识产权保护方面存在的问题。
3. 活菌数目不足 对以活菌菌体作为主要成分的菌剂产品进行评价，统一的标准是活菌数目，即有效菌数。保证有充足的活菌侵染豆科作物结瘤是实现增产的前提，是菌剂内环境保持稳定菌种活力得以保障的外在表现，也是菌剂产生经济效益的基本条件。但有效菌数过低仍是现今商用根瘤菌剂中普遍存在的现象[6]。Olsen等(1995) [7]发现北美40种菌剂产品在临近有效期结束时，菌剂的活菌数并不理想。只有一种菌剂中的根瘤菌数高于杂菌，而其他菌剂中的4份样品以MPN (standard most-probable-number，最大可能菌数)法无根瘤菌剂现存问题初探 22 法检测出根瘤菌。Gomez等(1997) [8]对阿根廷主要菌剂厂商的近20种菌剂的质量进行检测，指出虽然所有菌剂都含有具备优秀固氮能力的根瘤菌，但活菌数目均低于巴西国家标准。这主要源于菌剂内环境的改变和杂菌的污染。后者多因生产、包装和运输环节的监管和控制不力，即便各国的科研和质检部门提供了多种用于活菌数目检测和菌剂质量监控的方法和流程，但一些厂商还是不愿花费成本和精力进行严格的产品质量监控[9]。鉴于此，各国政府相继制订强制性标准来确保菌剂的活菌数，从5 × 107到1 × 109
个活菌/克菌剂不等[9]。法国对根瘤菌剂制订了最严格的质量标准，并要求对新上市产品进行统一的田间试验[10]。加拿大要求菌剂拌种后，至少达到小粒和大粒种你别附着103和105个活菌；在田间接种则要
求每公顷至少1011个活菌[11]；中国于2000年也颁布了根瘤菌肥料质量标准NY227-2000，要求每克菌
剂中的有效活菌数不得低于5 × 108个[12]。
4. 菌剂污染率及有效期 除菌剂内环境的偏酸、偏碱或有毒代谢物积累或以外，杂菌污染是造成根瘤菌数过低的主要原因[6] [7] [9]。Schwartz等(2006)指出，根瘤菌剂应尽可能的避免病原和杂菌的污染[5]。作为储存并维持菌种生活的场所，根瘤菌菌剂内环境及储运环节都有适宜菌体生存繁殖的养分、湿度和温度等条件[5]。菌剂在生产和贮运过程中[13]，一些包装上的瑕疵及破损成为外界环境中杂菌的侵入通道，一旦污染则可能损失整批次或整包装的菌剂产品，而当杂菌侵入后没有相应的抑菌措施，杂菌率很容易超标上千倍[14]。有研究指出：杂菌不但会与根瘤菌争夺养分和环境、还能产生大量有毒的代谢物降低菌种的生活力，使其大量死亡[7]。Olsen等(1995)调查发现：北美约40种的市售菌剂在存放1~2年后，细菌、放线菌和真菌的数量分别达到109~1010 g−1、108~109 g−1和105~107 g−1 [7]，只有一种菌剂中的根瘤菌数超过杂菌数，而部
分菌剂中杂菌数目超出根瘤菌上千倍。一些菌剂在污染后也无法由人眼直接识别，用于田间后才发现结瘤能力下降，但此时损失已无法挽回[15]。此类问题在全球范围内普遍存在，受害的中小型种植者遭遇风险后对根瘤菌剂失去信心，一些优质菌剂的市场也因此被破坏[6]。因此，菌剂的污染率限制被写入各国菌剂质量标准中最重要也最醒目的位置。肯尼亚和津巴布韦限定根瘤菌剂的污染率必须小于10%，澳大利亚政府要求菌剂污染率必须低于0.1% [16]，卢旺达限定菌剂杂菌率必须低于0.001% [17]，我国现行的微生物肥料标准(2006)要求菌剂产品的杂菌率低于10%，专门的根瘤菌剂标准NY227-2000则要求杂菌率低于10% [12]。菌剂污染率一方面由市场和政府进行监控，更多的是菌剂制造商的工艺改进和严格自律[18]。目前降低污染率的主要措施包括：(1) 使用严格灭菌的载体基质；(2) 严密封装，通过控制生产运输环境的净度降低杂菌的侵入几率[9]；(3) 使用冻干剂型，创造利于菌种休眠而不利于杂菌繁殖的环境；(4) 菌剂低营养化，以无营养材料吸附[19]；(5) 以高分子材料或矿物质固定化包埋菌体细胞[14]。以上方法都已取得了明显的效果并为企业所使用，但也存在一些问题，如包埋和控制环境净度对设备和工艺有一定要求，会使菌剂成本居高不下[17]。冻干或低营养化菌剂也会因温度巨变或养分不足而损失相当比例的活菌，降低菌剂的有效菌数[20]。 菌剂商品化要求其产品有足够长的有效期，而现有菌剂的有效期过短也是亟待解决的问题。除冻干剂型中的菌种基本处于休眠状态外，其它菌剂中根瘤菌都处在自由繁殖和生长的环境，短时间内的大量增殖，极易引起菌种因传代次数过多而退化。在旺盛的增殖期，营养迅速耗尽也会造成菌体大量死亡。目前国内大多数厂商采用临期或短期订单的产销模式，以避免在生产和贮运中闲置，从而保证菌种的活力和数量[21]。但由于菌剂的使用受作物生长期和栽培计划的影响，仅仅依靠临期或短期订购会使企业的发展受到限制，中小企业更无法抵御依赖短期行为生存的风险。因此正规产品只有4~5家实力雄厚的企业拥有生产根瘤菌剂的许可证，且只能季节性的根据订货安排生产。这一现状造成现有根瘤菌剂的研究和应用往往脱节，优良的菌种不能及时得到应用。