第22卷第2期 海 洋 水 产 研 究 V o l.22,N o.2 2001年6月 M A R I N E F ISH ER IES R ESEA RCH Jun.,2001微生物对石油烃降解代谢产物的分析方法研究冷凯良1 楚晓珉2 张辉珍2 李兆新1 尚德荣1 李晓川1(1中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛266071)(2青岛市产品质量监督检验所,266071)摘要 对实验室内微生物降解原油的代谢产物进行了色谱、质谱、紫外光谱等一系列研究,建立了微生物对原油代谢产物的分析方法。
实验表明,微生物降解原油代谢产物主要是乙酸和以棕榈酸为主的脂肪酸与鼠李糖形成的糖酯类表面活性剂。
关键词 石油污染 微生物降解 代谢产物 分析方法Study on analytical m ethods of m icrobi al m etabolites anddegradation to petroleu m hydrocarbonL EN G Kai2liang1 CHU X iao2m in2 ZHAN G H u i2zhen2L I Zhao2x in1 SHAN G D e2rong1 L I X iao2chuan1(1Yellow Sea F isheries R esearch In stitu te,Q ingdao266071)(2Q ingdao P roducts Q uality Supervising and T est In stitu te,266012)ABSTRACT B ased on determ inati on of GC,GC M S,U V,a series of analytical m ethod fo r m icrob ial m etabo lis m and m etabo lic p roducts has been develop ed.T he resu lt indicates that the m ain m etabo lic p roduct of p etro leum hydrocarbon degradati on is acetic acid and su rface active agen t of glyco li p id com po sed of fatty acid and rham no se.KEYWORD S Petro leum po llu ti on M icrob ial degradati on M etabo lic p roductsA nalytical m ethods 石油污染是严重的海洋污染物之一。
随着海洋石油资源的开发以及海上交通运输业和沿岸石油化工业的发展,海洋石油污染日益严重。
进入海洋环境的石油污染物质大部分滞留在海洋底栖环境中,因而极大地影响着海洋底栖生物的正常生长。
海洋环境中大量石油污染物的存在,使海洋水质下降,严重破坏了海洋生态环境。
有关石油在海洋环境中的迁移、降解和对海洋生态系统影响的研究已引起了国内外的广泛关注。
一般认为微生物将降解大部分海上原油成分,有关利用微生物降解石油烃类,消除石油污染的文献很多,但由于原油组成和微生物代谢体系的复杂性,目前在代谢作用及产物分析方法方面仍然没有系统的可以遵循的方法。
微生物代谢作用及产物分析方法的研究,对认识微生物降解石油污染物的机理有重要理论意义。
对新型微生物菌种的筛选及性能评价工作亦有重要的实用价值。
为此,作者在实验室内选择大港油田的原油作为微生物的唯一碳源,对其代谢产物进行了分析研究,并在一系列实验研究的基础上,建立了微生物对原油的降解代谢产物的分析方法。
收稿日期:2001203216;接受日期:200120422085海 洋 水 产 研 究 第22卷1 材料与方法1.1 实验材料N a2H PO4・12H2O,KH2PO4,M gSO4・7H2O,FeSO4・7H2O,N aNO3,CaC l2,酵母膏,N80菌种(假单孢菌属,革兰氏阴性)。
原油:大港油田G6928原油。
1.2 实验仪器灭菌锅,发酵罐,高速离心机,真空泵,pH计,气相色谱仪,气相色谱2质谱联用仪;高效液相色谱仪和紫外分光光度计。
1.3 发酵培养方法按比例配制发酵培养基,高温灭菌。
开动发酵反应器,进行接种发酵。
发酵温度:60℃,搅拌速度:200r m in,发酵时间:8d。
1.4 样品处理发酵结束后,用微孔滤膜进行油水分离,水相进一步处理后进行代谢产物分析,油相进行降解后组分的定性分析。
1.5 小分子有机酸的分析1.5.1 总酸测定取连续发酵8d的发酵液,过滤去油,离心除菌后测定。
测定方法:取离心后发酵液20m l,加2滴甲基红2亚甲基兰指示剂,用C(N aO H)=010209m o l L标准溶液滴定,同时以发酵前溶液为空白进行空白滴定。
1.5.2 小分子有机酸的分离提取方法A:取发酵液300m l,经0145Λm滤膜过滤去油体,水相经高速离心(8000～10000r m in)除菌后,置于蒸馏瓶中,用10m l磷酸酸化,在接收瓶中放入少量蒸馏水并使冷凝管浸入其中,加热蒸馏,蒸馏至剩下少量溶液时,稍冷,加入20m l蒸馏水,继续蒸馏(蒸出液中含有短链有机酸,残液中含有长链有机酸),馏出液用5%N aO H中和至pH为8,冷冻干燥浓缩至5m l后,将试样转入10m l容量瓶中,用盐酸酸化至pH为3,定容。
取1Λl做GC2M S分析。
方法B:用发酵培养液50m l加入2滴1∶3的硫酸使pH降至315左右,离心20～30m in,(离心速度为8000～10000r m in),取上层透明清液10m l,加入015m l甲酸(A R),使最终pH为2左右,直接进样进行GC或GC2M S分析。
1.5.3 小分子有机酸的定性实验通过气相色谱进行小分子有机酸的分离,运用质谱及标准品保留时间对小分子有机酸进行定性。
(1)色谱柱的选择 将H P21、H P25、H P2FFA P、H P2Carbow ax20M等弹性石英毛细管柱对小分子有机酸的分离性能进行比较,选择出最佳分离效果色谱柱。
(2)气相色谱条件 色谱柱:H P2Carbow ax20M(30m×0125mm×015Λm);进样口温度:150℃;初始柱温:50℃;恒温4m in;以15℃ m in的升温速率;到150℃;维持20m in,载气:H e气;016m l m in(恒流控制),检测器:F I D,检测器温度:180℃。
(3)质谱条件 离子源:电离源;扫描范围:15～200质量数;溶剂延迟:3m in。
1.6 表面活性剂分析1.6.1 表面活性剂的分离及定性将发酵液过滤,离心除菌体,取一定上清液,调pH 为2,放置冰箱(4℃)过夜,观察是否有白色沉淀产生,若是脂肽类表面活性剂应有白色沉淀产生,糖酯类表面活性剂不产生白色沉淀。
上清液加入等体积的氯仿 甲醇(V ∶V =2∶1)溶剂,提取2次,水洗,60℃减压蒸干,氯仿洗涤,70℃蒸干,得表面活性剂干品。
取少量上述干品,加氯仿溶解后做硅胶薄层分析,显色剂用1%蒽酮硫酸或钼酸铵2高氯酸显色。
1.6.2 糖酯中糖基的定性将样品加热酸解,用5%碳酸钡溶液中和,离心后取上清液做纸层析,用氨性硝酸银显色,对照标准品计算R f 值。
1.6.3 糖酯中酯基的定性(1)糖酯的水解处理 将1.6.1节所取得的样品中加015m o l L 的氢氧化钠甲醇溶液5m l ,将其密封在10m l 的安培瓶中,置于90℃水浴中加热水解2h ,敲碎安培瓶,将样品取出,加水并酸化后用乙醚萃取,静置,分成醚相和水相。
(2)长链脂肪酸的甲酯化 糖脂经水解后,水相产物为糖,有机相产物为长链脂肪酸,在45℃减压蒸馏将醚相蒸去溶剂得到脂肪酸样品后,加入10m l 含量15%的氯化氢甲醇溶液,将其密封在10m l 安培瓶中,在100℃下将脂肪酸甲酯化20h ,敲碎安瓶,然后用氮气吹干,将其溶于1m l 正己烷中,进行GC M S 分析。
(3)色谱条件 色谱柱:H P 2Carbow ax 20M (30m ×0125mm ×015Λm );进样口温度:230℃;初始柱温:150℃,以3℃ m in 的升温速率,到200℃,维持20m in ;载气:H e 气,016m l m in (恒流控制)。
检测器:F I D ,检测器温度:250℃。
(4)质谱条件 离子源:电离源;扫描范围:30～300质量数;溶剂延迟:3m in 。
2 结果2.1 总酸测定连续发酵8d 之发酵液中总酸含量(以乙酸计)为010056m o l L 即01336g L 。
2.2 小分子有机酸分析GC 2M S 分析结果表明,以H P 25等非极性或弱极性毛细管柱分析小分子脂肪酸峰形有拖尾现象,以H P 2Carbow ax 20M 的分离效果为最佳。
小分子有机酸的质谱及标准品保留时间定性结果为乙酸。
色谱图见图1。
图1 发酵液中小分子酸色谱F ig .1 T he GC 2M S spectrum of o rgan ic acid in the ferm en ted cu ltu re m edium95第2期 冷凯良等:微生物对石油烃降解代谢产物的分析方法研究2.3 表面活性剂分析发酵得表面活性剂,调pH ,放置冰箱(4℃)过夜,没有白色沉淀产生,推断所产生表面活性剂不是脂肽类表面活性剂。
硅胶薄层分析,1%蒽酮硫酸显色,显黄色斑点,钼酸铵2高氯酸显色呈蓝黑色斑点,均表明样品为糖酯类表面活性剂。
糖酯中糖基经纸层析分析,用氨性硝酸银显色,对照标准品计算R f 值,样品的R f 值与鼠李糖的R f 值相同,表明N 80菌种代谢后产生鼠李糖酯。
糖酯中酯基经GC 2M S 分析,定性结果得出,N 80菌以大港油田原油为碳源,发酵产生的糖酯经水解后的脂肪酸中含有棕榈酸、正十七碳酸、十九碳酸、油酸和亚油酸,其中棕榈酸含量最多。
糖酯水解产物中长链脂肪酸色谱图见图2,糖酯水解产物中棕榈酸质谱见图3。
图2 糖酯水解产物中长链脂肪酸色谱F ig .2 T he GC 2M S spectrum of fatty acid in the glyco li p id hydro lysate3 讨论发酵过程中,出现pH 降低及乳化现象,根据产物的化学定性及仪器定性结果,进行了分步分离鉴定,并进行了分析方法的优化得到以下认识。
3.1 短链有机酸的分离与分析气相色谱法测定水溶液中的有机酸,通常是将水样蒸馏浓缩后进行酯化萃取,过程繁琐,受到酯化效率的影响,并且常常受到其他有机组分的干扰。