RT-PCR技术的数据分析
相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基 因
在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小
内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组 数量
RT-PCR技术的数据分析 PCR分四个阶段
SYBR Green法优缺点
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with TaqMan（ TaqMan法）
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan法
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan探针法优缺点
RT-PCR技术的数据分析
•绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
PCR扩增循环数
2. Ct 值的定义
在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —
— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的
循环数（如图所示）。
RT-PCR技术的数据分如析 何定量？-ΔΔCt
5.0μl
F(F’)
0.25μl
R(R’)
0.25μl
荧光染料 SYBR Green I 荧光标记的探针TaqMan探针法
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye（SYBR Green 法）
变性
退火
延伸
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR技术的数据分如析 何定量？-ΔΔCt
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
PCR扩增循环数
1. 荧光域值（threshold）的设定
在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才能够 被检测到，一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底 信号。
RT-PCR技术的数据分如析 何定量？-ΔΔCt
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR) 的原理与应用
实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义 二、RT-PCR技术的原理及试验流程 三、RT-PCR技术的数据分析
四、RT-PCR技术的应用
实时荧光定量PCR的定义
普 通
PCR
PCR
电泳
在PCR结束后对 终点产物 进行定量分析
RT-PCR技术的数据分析
SYBR Green 熔解曲线分析
ห้องสมุดไป่ตู้
谢谢大家！
RT-PCR技术的数据分析
RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近 100％且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值： ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control) 2、用试验样本的ΔCT值减校准样本的ΔCT 值：
？ 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和
相应的为软 什么选择对初始模板定量 件分析结果，而对不待是测样终品产的物初定始模量板进行定量或
定性分析。
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系
模板
4.5μl
Tag mixture
标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
RT-PCR技术的数据分析
3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存
在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝 数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对 数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从 标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR 产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和 相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或 定性分析。
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR 产物进行
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
PCR扩增循环数
3. Ct值与起始模板的关系
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存
在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝
数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对
数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从