原花青素类化合物结构、含量测定及其功能研究进展1 简介原花青素（Proantho Cyanidins，PC），又名缩合鞣质，可视作花青素（ cyanidin）类物质的聚合物，是自然界中广泛存在的一类多酚类化合物。

通常将从植物中分离得到的一切无色的、在无机酸存在和加热处理下能产生红色花青素（ cyanidin）的一类多酚化合物统称为原花青素（赵平2011）。

最初是在20 世纪40 年代从花生仁的包衣中提取出来，在50 年代又被法国科学家从海松树皮中发现并提取出来，并将其提取率提高到达85%。

近来，研究证明原花青素是很强的抗氧化剂，可以清除自由基，其抗氧化、清除自由基的能力是维生素E的50 倍、维生素 C 的20 倍，能防治80 多种因自由基引起的疾病，包括心脏病、关节炎等，还具有改善人体微循环功能（张长贵2009）。

目前，原花青素作为营养强化剂、天然防腐剂、天然抗氧化剂、DNA 保护剂等，被广泛应用于食品、药品、化妆品等领域。

2 化学结构及分类原花青素是以黄烷-3-醇为结构单元通过C-C 键聚合而形成的化合物，起初称为黄烷醇类或归于缩合鞣质。

其结构分类主要取决于五方面：（1）黄烷-3-醇单元的类型；（2）单元之间的连接方式；（3）聚合程度（组成单元的数量）；（4）空间构型；（5）羟基是否被取代（如羟基的酯化、甲基化等）。

根据原花青素的聚合程度可分为单倍体（monomer）、寡聚体（oligomer）和多聚体（polymer）（Alan et al 2008 ）。

其中单倍体是基本结构单元，寡聚体由2～10 个单倍体聚合而成，多聚体则由10 个以上的单倍体聚合而成（张慧文2015）。

2.1 单倍体单倍体是构成原花青素的结构单元，属于黄烷-3-醇类化合物，该类成分可通过一定方式连接形成原花青素。

单倍体一般是儿茶素（catechin）和表儿茶素（epiactechin），但是也有其他的单倍体，如多一个羟基的表没食子儿茶素（epigallocatechin）或少一个羟基的表阿夫儿茶精（epiafzelechin）（LELONO et al 2013 ）。

上述4 种单倍体的化学结构如图 1 所示：A.儿茶素；B.表儿茶素；C.表没食子儿茶素；D.表阿夫儿茶精图 1 单倍体的化学结构2.2 寡聚体寡聚体是指由2～10 个单倍体通过一定方式连接起来的化合物，该类成分是原花青素研究中活跃的部分,不断有新的化合物被报道。

寡聚体的分类标准有聚合度、连接方式和单倍体类型：聚合度是指组成原花色素的结构单元个数，是区分原花青素的重要标准之一。

寡聚体的连接方式有两种，一种为单倍体通过C2—O—C7的醚键和C4—C8或C4—C6两个键连接在一起，称之为 A 型(A-type procyanidins)；另一种为单倍体通过C4—C8 或C4—C6 一个键连接在一起，称之为 B 型( B-type procyanidins)，如图 2 中所示。

在自然界中，多数植物含有的是 B 型原花青素，只有少数植物，如花生、荔枝和肉桂等富含 A 型二聚体(Li et al 2013)。

大多数寡聚体的结构单元是儿茶素或表儿茶素，但是也有少数寡聚体是由表没食子儿茶素或表阿夫儿茶精组成的。

A. 原花青素A1；B. 原花青素B1图 2 寡聚体的化学结构2.3 多聚体多聚体是指聚合度大于10 的原花青素，由于分子结构庞大，一般是以混合物的形式存在，该类化合物很难分离得到单体，其化学结构通常以图3中的形式表示。

多聚体通常以分子质量区间来定义，其鉴定也和单体原花青素不同，通常是检测其构成单元的类型和种类，以及连接方式的类型（Lin et al 2010）。

图 3 多聚体的化学结构3 原青花素的提取方法3.1 有机溶剂提取法考虑到原花青素物质的结构，可利用有机溶剂断裂氢键，但是由于有机溶剂渗透性较差，一般需要以水作为传导介质。

常用有机溶剂极性大小顺序为: 甲醇＞乙醇＞丙酮＞乙酸乙酯。

综合评价溶剂的极性和毒性，乙醇溶解性好，毒性低，细胞穿透能力强，价格低廉，可以重复利用，所以一般采用乙醇提取。

郑洪亮等（2014）利用60%的乙醇从红皮云杉球果中提取出原花青素。

张镜等（2014）利用70%丙酮溶液及60%的丙酮-乙醇混合液（混合液由70% 丙酮: 70% 乙醇按3：2比例组成），从阴香花中提取出较高含量的原花青素。

有机溶剂提取法的废液污染环境对人类健康存在威胁，从环保与经济利益等方面考虑，新型提取方法的开发非常有必要。

3.2 超声提取法超声的机械作用可以破坏细胞壁，加强细胞内的传递作用。

超声波破碎过程不会改变样品化学成分的结构与性质，可以加快植物中有机化合物的提取速度。

超声过程形成的高温高压环境，对提取热敏感的原花青素具有一定的优越性。

余修亮等（2018）对莲子壳中含有的原花青素的超声提取工艺和抗氧化活性进行研究，其得到了最优工艺条件为液料比33∶1（ mL/g ）、丙酮体积分数70%、提取功率720 W、提取时间21 min 。

在此条件下，测得莲子壳中原花青素提取率为43.96 mg/g，且其中含有抗氧化活性较强的天然抗氧化剂。

3.3 酶提取法植物细胞壁是由纤维素、半纤维素、果胶质、木质素等物质构成的致密结构。

选用适当的酶可以破坏细胞壁的这种结构，加速有效成分溶出。

崔晶蕾等（2018）考察了加酶量、超声波功率、超声波时间对紫色花椰菜原花青素提取率为响应值。

通过建立紫色花椰菜原花青素提取率的二次回归方程，得出最佳提取工艺为加酶量 2.08%、酶解温度50℃、超声波功率316.63 W 、酶解时间40 min 、超声波时间25.86 min 条件下，紫色花椰菜原花青素提取率最大，最大值14.36%。

顾焰波等（2017）以板栗壳为原料，采用纤维素酶法辅助提取原花青素。

在单因素试验的基础上，采用L~9（3~4）正交试验设计，研究酶解温度、提取时间、酶解浓度和pH 对板栗壳中原花青素得率的影响。

其最佳工艺条件为：酶解温度50℃，提取时间90 min，酶解浓度 1.00%，pH 4.5。

所得板栗壳中原花青素的得率为0.465%。

3.4 超临界流体法超临界流体提取技术具有选择分离效果好、提取效率高、产品纯度好、流程简单、能耗低等优点，广泛应用于天然产物的提取分离。

常用超临界流体是CO2。

颜雪琴等（2018）研究了以乙醇为夹带剂进行超临界CO2 萃取石榴皮原花青素的工艺。

采取单因素试验结合正交法对石榴皮中原花青素的提取工艺进行优化，试验得到石榴皮中原花青素提取的最佳工艺为：乙醇体积分数65%，CO2 流速为 5 L/h ，提取时间58 min ，料液比1∶ 1.3，提取温度48℃，提取压力35 MPa，此工艺条件下原花青素的提取率可达 3.40%。

4 含量测定方法4.1 分光光度法4.1.1 Bate-Smith 法和Porter 法Bate-Smith 法是利用原花青素在酸性条件下加热可转化为红色花青素的原理来测定原花青素含量, 用原花青素质量与样品总质量的比例来表示。

由于Bate-Smith 法测定的结果重现性差, 并且原花青素在此条件下反应不彻底。

因此, Porter 等对Bate-Smith 法进行了改进, 在正丁醇-盐酸反应体系中添加了Fe3+, 从而提高了反应速率和产物的稳定性。

Porter 法又被称为铁盐催化比色法或正丁醇-盐酸法, 该方法具有较好的重现性和准确性。

李华等( 2007)采用Porter 法测定了葡萄籽中的原花青素, 反应体系选择正丁醇：浓盐酸：10%硫酸铁铵=83:6:1(v/v/v), 沸水浴中加热40 min, 冷却后, 于550 nm 下检测吸光度, 测得葡萄籽中原花青素含量为11.24%, 相对标准偏差(RSD)为 1.40%, 加标回收率为96.6%。

4.1.2香兰素法香兰素法是利用原花青素在酸性条件下与香草醛发生显色反应来测定原花青素的含量。

在酸性条件下时, 黄烷-3-醇单体的 A 环化学活性较高, 其间苯三酚或间苯二酚与香草醛会发生缩合反应生成香兰素-表儿茶素, 产物在浓酸作用下形成有色复合物。

采用分光光度法在500 nm 下测得有色产物的吸光度, 根据标准曲线即可计算样品中原花青素的含量。

香兰素法所测得结果比真实值偏高, 精密度比Porter 法更好。

李绮丽等( 2012)采用该方法测定莲子皮中的原花青素含量, 其最佳条件是：0.5 mL 提取液，加入 3.0 mL 4%香草醛甲醇溶液以及1.5 mL 盐酸甲醇溶液, 反应温度为30℃，反应时间为20 min，测定波长500 nm。

4.1.3 钼酸铵法钼酸铵法是利用钼酸铵与原花青素在弱酸性条件下生成黄色钼酸铵酯，通过检测产物黄色钼酸铵酯的含量间接测得原花青素含量，其规律符合朗伯比尔定律。

马亚军等( 2003)用此方法测定了葡萄籽提取物中的原花青素，得出线性回归方程为A=0.0108C (μg/mL) - 0.0042，相关系数为r=0.9995，确定了钼酸酯在333 nm 处有最大吸收值，pH 3~7 范围内吸光值稳定。

此方法具有较好的选择性, 但灵敏度和准确度稍低。

4.1.4 紫外吸收法紫外吸收法是利用原花青素自身含有的芳香环经紫外光或可见光照射使其价电子能级跃迁，形成吸收光谱这一特性来测定原花青素含量的方法。

这种方法可直接测定原花青素含量，不需显色反应。

应用紫外分光光度法还可快速测定出原花青素的平均聚合度(mDP)，其原理是以传统的分光光度法来测定原花青素的总质量(单体及聚合体)，然后再用冰乙酸为溶剂，使香草醛只与原花青素末端黄烷-3-醇反应来测定原花青素的物质的量，进而求出原花青素的平均聚合度。

mD = M1/M2(×n); 其中M 1为原花青素质量(g); n为原花青素物质的量(mol); M2为平均分子量。

分光光度法是目前检测原花青素的常用方法，具有简单、快速、灵敏等特点。

综上可知Bate-Smith 法、Porter 法选择性较好; 紫外吸收法对不同聚合度的原花青素的选择性较差，但精密度较高; 香兰素法以及钼酸铵法的灵敏度、精密度和选择性较为适中，适于食品原花青素质量指标的监控检测。

4.2.1 HPLC-MS 法高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS) 是通过样品前处理得到原花青素粗提物，再利用高效液相色谱-质谱进行定性定量分析的方法。

如将样品在酸性条件下加热水解, 使原花青素C-C 键断裂生成游离的花青素, 再用高效液相色谱-质谱进行分析花青素成分, 从而对样品中原花青素物质进行定性、定量检测。

HPLC-MS 法是一种高效可靠的分析方法。

黄海潮等 (2018)建立了测定龙眼果核中原花青素含量的方法。

其采用了Inertsil ODS-3 C 18色谱柱( 4.6mm×250 mm，5 μm); 流动相为甲醇、乙腈与水，比例为50:35:15，流速:1mL/min ，检测波长为280 nm。