基金项目:成都医学院“实验室开放基金课题”资助(S YSKF200748)。

作者简介:薛斌(1984-),男,成都医学院2005级临床本科班学生,研究方向:小鼠空间记忆障碍时效关系研究。

△通讯作者:荣成(1980-),男,助教,成都医学院基础医学实验技术中心科研秘书,研究方向:小鼠空间记忆障碍时效关系研究。

阿尔茨海默病动物模型建立方法的论述薛　斌1　荣　成　张　晓2　杨　拯2　江红丽2(1.成都医学院2005级临床本科甲班　2.成都医学院实验技术教研室)[摘　要]学习记忆能力障碍是老年性痴呆(Alzheimer ’s disease,AD)的主要临床症状和特征,而目前对阿尔茨海默病的发病机制有三种有影响力的学说。

因此理想的阿尔茨海默病AD 动物模型,对研究该病的发病机制及治疗具有重要意义,本文就目前几种有影响力的AD 的动物模型研究现状作一综述。

[关键词]阿尔茨海默病　穹窿海马伞　胆碱能神经元　T au 蛋白　β-淀粉样肽 阿尔茨海默病(Alzh eimer ’s disease ,AD )是一种临床常见的中枢神经系统变性疾病,目前其发病机制有三种影响力的学说,如淀粉样蛋白学说、乙酰胆碱能学说、线粒体损伤学说。

现关于AD 疾病的研究日益受到国内外学者的高度重视。

其建立一个可靠的A D 动物模型是研究AD 的重要环节。

有关AD 动物模型建立的方法较多,各有利弊,本文针对这几种学说的AD 动物模型的建立和新的动物模型的建立作一综述。

一、自然衰老认知障碍AD 动物模型AD 是一个与年龄相关的疾病,衰老因素在AD 发病过程中扮演着重要角色,衰老所特有的病理生理变化及其它病变的影响,是用年轻动物制作的动物模型所不能替代的。

通过行为筛选的方式,选择带有认知和记忆严重缺失的个体,它们的行为损害与老年人和A D 患者的认知损害相类似,同时还可出现某些相应的脑组织病理改变[1]。

故是研究AD 较好的动物模型。

但存在以下缺点:①老年动物神经系统的发病与A D 的发病机制过程不完全一致,因此神经化学方面的改变也是不同的。

②体质差,易死亡,故不宜用于周期长的实验。

③对药物的吸收代谢不佳。

④价格昂贵。

所以该模型的应用受到一定限制。

二、损害模型的AD 动物模型1.断开穹窿海马伞通路模型早在1954年,Daitz 等人就采用横断穹窿海马伞系统来研究观察神经元的退化过程。

后来人们为了进行AD 方面的研究,采取了真空抽吸、横断或电解等方法损毁单侧或双侧穹窿海马伞通路建立AD 模型[2-3]。

此种方法主要是通过切断隔海马通路(如扣带束、背穹窿海马伞),破坏胆碱能及非胆碱能纤维传入,导致实验动物行为及神经化学方面的缺损,造成动物空间定向和记忆障碍及胆碱能神经元的丢失。

1994年在此基础上,Jeltsch 等的实验研究结果表明,切断双侧穹窿海马伞通路造成的A D 模型在数月后其行为及神经化学的缺失也不能恢复[4]。

该模型是建立在“AD 认知障碍的胆碱能假说”的基础上,基底前脑的胆碱能细胞发出轴突广泛地投射到新皮质和海马等高级脑区,这一投射与学习记忆和认知功能有着密切的联系。

在任何一个环节阻断或损坏这一投射系统都可导致动物认知障碍和学习记忆能力的损害。

其病理检查发现A D 患者基底前脑的胆碱能细胞出现严重溃变,其细胞丢失的程度和患者的认知能力成负相关关系[5]。

如通过手术、化学或免疫切除的方式损伤基底前脑——海马胆碱能投射,来模拟AD 的前脑胆碱能系统的损害,可用于①研究前脑胆碱能系统选择性损害对AD 的记忆减退与认识障碍的临床症状的关系的研究;②拟胆碱药物治疗A D 的药物筛选、疗效评价和作用机制的研究;③胚胎基底前脑胆碱能细胞脑内移植治疗AD 的实验研究;④神经营养因子如N G F 等脑室投递治疗A D 的研究以及N GF 或其它神经营养因子基因修饰细胞脑内移植对A D 进行基因治疗的研究等。

用此方法建立A D 模型,周期短(约两周),但手术定位难以控制,很难避免手术区邻近组织的受损。

故此方法基本不再运用。

2.慢性缺血痴呆模型脑的供血不足可以导致脑损伤和一系列的临床症状,加拿大学者To r re 报告用老年动物慢性脑缺血模型引起的行为缺失和脑组织病理生理改变在许多方面与人类的老年期痴呆包括AD 相类似[6]。

慢性缺血痴呆模型是通过结扎老年大鼠的双侧颈总动脉和一侧椎动脉或者一侧锁骨下动脉,造成脑的长期供血不足和相应的脑损害,这些脑损害与AD 的临床表现和病理改变有一定相似性[6]。

其特点为:①脑组织长期供血不足;②只有老年动物长期缺血才出现恒定的行为损害和病理改变,年轻动物长期缺血造成的损伤是一过性的。

基于该模型的制作机理和特点,考虑到临床上有不少AD 患者同时合并有脑血管型痴呆和脑供血不足,我认为这一模型适用于研究混合性老年期痴呆的发病机制和有关药物治疗的研究。

3.鹅膏蕈氨酸(Ibo tenic acid ,IBO )损害模型IBO 是一种谷氨酸受体激动剂,具有强烈的神经兴奋毒性作用,通过与神经元胞体或树突上的N M DA 受体相结合导致神经元中毒性损伤而溃变。

基于基底前脑神经元丢失在衰老和AD 有关的认知缺失中的重要作用,以谷氨酸类似物微量注射到基底前脑导致其神经元溃变和认知缺陷。

制作A D 模型最常用的谷氨酸类似物主要有海仁酸(Kainic acid,K A)、IBO 和使君子氨酸(quisqualic ,Q U IS )。

其中以IBO 最为首选,尽管IBO 和Q U I S 都能造成基底前脑胆碱能神经元溃变,但只有IBO 能恒定地损害动物学习记忆有关的行为执行。

基底前脑细胞对K A 的敏感性较低,故用量较大,易引起动物死亡,并往往在导致基底胆脑细胞损害的同时引起其它部位神经元(如海马锥体细胞)的死亡[7-8]。

4.Okadaic acid 慢性损害AD 模型Okadaic acid(O A)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化酶的特异性抑制剂,O A 的长期脑室投递可引起动物的记忆严重缺失,同时导致脑内A β淀粉样沉积斑块形成以及N F T 样磷酸化Tau 蛋白出现。

O A 损害模型是利用O A 对丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化酶的特异性抑制作用,以及它对蛋白激酶C (PK C )的激活作用。

丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化酶的抑制可以使T au 蛋白过磷酸化,导致N FT 的形成。

同时,PK C 激活,丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化酶的活性抑制,可剌激A β产生,进而引起A β的沉积和老年斑的形成[9]。

由于O A 对蛋白磷酸化酶,丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化酶的抑制作用和提高PK C 的活性,并能同时复制出AD 的二大分子标志有关的病理改变——老年斑和N F T ,该模型具有明显的优势主要适用于:①研究AD 发病的病理机制,A β和Tau 蛋白代谢异常与A D 病理的关系,以及A β和Tau 在AD 病变中的相互作用。

②从另一角度验证现有AD 治疗方法—16—和药物的疗效。

5.铝元素中毒模型正常人脑组织铝的含量1.8±0.8μg/g(干重)或1.22μg/g (湿重),正常大鼠脑内铝含量为1.1μg/g(干重)[10-11]。

已被公认,铝在体内一些部位的异常蓄积可产生毒性作用。

早在1937年Sch erp和Church就提出铝可引起神经元退化的看法[11]。

1965年Klatzo和Ter ry等提出铝中毒可能与AD发病有关,他发现A D病人与铝中毒病人脑中均可见N F T[12]。

此后1973年Cra pper等人提出铝可能是神经毒素,他们给猫脑内直接注射铝盐,发现铝具有神经毒素样作用,导致神经纤维变性[13]。

国内有学者采用给大鼠[正常大鼠脑内铝含量为 1.1μg/g(干重)[10-11]]或小鼠腹腔注射或口服铝盐建立AD模型[14],结果模型鼠出现大脑重量减轻,学习记忆减退表现。

临床资料表明A D 病人脑内铝含量显著高于正常值[15];血清铝的水平也明显高于对照组[16]。

纵观有关铝与AD的实验研究,已基本肯定:AD病人脑内铝的含量明显超过正常值;铝对中枢神经系统有毒性损害,使神经元变性或死亡,产生N F T病理性改变,继而表现为大脑皮质萎缩,脑重减轻;出现记忆、认知功能障碍。

有关铝和β-淀粉样肽关系的研究,结果表明铝可以引起β-淀粉样肽在脑内沉积和β-淀粉样前体蛋白在神经元的过度表达[17-18]。

因此,我认为,用铝诱导建立A D模型的方法较好。

缺点是此种A D模型出现的N F T与AD病人的略有差异,再就是用铝造模周期长。

6.Aβ注射模型SP是AD的重要病理学改变之一,Aβ是SP的主要成分。

越来越多的实验证明Aβ在A D发病中起重要作用。

体外实验证明Aβ在μmol/L浓度时即对神经元产生毒性作用。

脑内急性注射Aβ可使动物产生与A D相似的行为障碍和记忆缺损症状,并出现Aβ沉积。

所以,急性注射Aβ目前是一种较好的动物模型,常采用的方法有海马内单点注射、海马内多点注射等[19-20]。

Aβ1-40海马注射AD模型为在体水平研究Aβ介导神经损伤的神经病理机制提供时间和空间上较易控制的条件。

此种模型可迅速建立学习记忆障碍,损毁部位明确,与学习记忆相关海马脑区锥体细胞丢失明显且局限,而且可以通过调整Aβ注射量来控制模型的行为与组织病变程度。

另外也为后期的细胞定位移植治疗模型提供适宜的模型条件[21-22]。

Aβ1-40单侧海马注射AD模型大鼠尽管可以模拟人类AD疾病的部分特征病理改变,但是不能模拟疾病渐进性的病理学改变。

三、转基因型AD动物模型关于转移基因小鼠的研究始于八十年代末,1991年Q uo n 等人先后进行了有关报道[23]。

在1993年第23届美国神经科学年会上Felenstein等报告了建立转移基因大鼠模型。

1995年美国Athena neuro siences Inc and Eli Lilly&Co.公司宣告用遗传工程方法建成了AD动物模型,即转移基因小鼠。

他们采用人体异常App的基因向小鼠胚胎细胞插入而建立的。

App基因是编码淀粉样蛋白的基因,这种蛋白在体内能释放出β-淀粉样肽,β-淀粉样肽在AD患者脑内老年斑中大量存在。

与上述所有方法相比,此种模型能较好模拟出与AD有关的记忆损害和形态变化。

AD转基因的动物模型近年来的进展非常迅速,各种A D 转基因模型不断被报道。

现有的模型大多数是将不同结构的App基因转移到受精卵,但真正理想的转基因模型尚不多见。

Ga mes D等(1995)报道了App突变体(V al717-Phe)转基因小鼠,显示了老年斑、Aβ沉积等A D的病理改变,该模型认知能力尚不清楚。

转基因鼠(JU)表达人野生型App751,显示了空间记忆的损害,但只有4%的转基因鼠饲养到12个月以上才展示了Aβ的沉积,且Aβ沉积的量很少,不能被刚果红染色[24]。