血友病是目前SGT最有希望达到 理想疗效的遗传病病种
•现行血友病B治疗手段、效果不理想 •单基因遗传病 •不需要精确的表达调控，无需所有细胞表达 •表达广谱 •理想的动物模型（二个狗品系，3个小鼠品系） •疗效易于评价 血友病A：100-200ng/ml 血友病B: 5000ng/ml
血友病B基因治疗靶细胞选择
FAXW(小剂量组) FAXW(静脉缓慢注射组) FAXW(大剂量组) FUXW组 PBS对照组
重组FAXW.FUXW病毒在血友病B小鼠体内表达 hFIX的时效曲线
宫内胎鼠基因治疗
•非病毒途径导入基因：尾静脉大容量快速注射法
尾静脉大容量快速注射裸DNA能够介导外源基因在动物肝内高效表达， 我们以凝血因子Ⅸ（hFⅨ）为报告基因建立了尾静脉液压法裸质粒 转移体系。
400
6
300
200
100
0 weeks 0 0.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
mFIX level (ng/ml) -3 13 29 45 65 89 111 135 161 187 220 281 350
Expression of mFIX in Hemophilia B Mouse
2、血友病B基因治疗的实践与发展
血友病B（ Hemophilia B） 是一种由于凝血因子IX基因 （hFIX）发生突变而引起的出血 性疾病。其症状表现为自发性出 血，严重者可因关节出血导致关 节变形和残废甚至死亡。该病为X 染色体连锁，在男性中发病率大 约为1/100,000。
血友病目前的临床治疗方法：
ex vivo:
皮肤成纤维细胞 角质细胞 内皮细胞 上皮细胞 成肌细胞 造血干细胞 骨髓基质细胞 支持细胞
In vivo:
直接、连续注射
尽管人体天然的FVIII和FIX都是由肝 细胞产生的。然而，实验证明，由非肝 细胞如CHO产生的重组凝血因子与人体 天然的凝血因子在活性和免疫原性上没 有差别，到目前为止没有发现非肝细胞 产生的凝血因子有不同寻常的翻译后修 饰。
疾病的基因治疗
复旦大学 遗传学研究所 薛京伦 2003，10
基因治疗几个发展时期
1980-1989 准备期 1990-1995 狂热期 1996-至今 理性期
技术、宗教，伦理，法律 公众，媒体 出现临床结果
人体基因治疗是一个多环节的复杂过程
•基因导入靶器官、靶组织、靶细胞间的交流 •基因表达水平和时空调控 •基因表达产物生物活性 •载体安全性 还存在许多迷惑和问题
HIV是基因组结构及基因
调节机制最为复杂的逆转 录病毒之一,基于HIV的重 组反转录病毒载体，能广 泛感染各种非分裂细胞,也 保留了能够整合在宿主染 色体上的特点.且免疫反应 小,重组HIV是一个很有发 展潜力的病毒载体
50
40 30 20 10
0 5 10 15 20 30 40 50 60 时间/天
600
C2C12
500
400
300
200
100
0
Plasmids CIX CIXR Cm
CmR
Em
EmR
Bm
In vitro Expression of AAV/mFIX
mFIX level (ng/106cells/24 h)
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
Treated hemophilia B mice 48.33+/-15.46
7.5+/-3.56 34.58+/-4.29 34.2+/-4.17
Bleeding Assay
3.2' <40ul APTT <20''
30‘ 430ul APTT >100"
7.5‘ 50ul APTT 34"
抗IX因子抗体分析
mFIX in vivo expression
800
A
700
B
600
C
D
500
E
400
F
G
300
H
200
I
100
0
days post injection
血友病小鼠经rAAV基因治疗后, FIX凝 血活性提高, 出血症状改善
Table1. Bleeding times and clotting functional assays
C57 mice
Blood lost over 5min （ul） Bleeding times（Min） APTT（Sec） IX activity（％）
36.67+/-14.04
3.17+/-1.11 20 70~130
Hemophilia B mice
428.33+/-51.69
>30 >100 <3
蛋白替代法：输血、输凝血酶原、注射重 组FVIII， FIX，能有效地改善出血症状和 延长生命，但是昂贵，且存在感染HIV， HBV（乙肝），HCV（丙肝）风险
蛋白替代法可导致抑制物产生，从而使治疗失效 血友病A 有10 -40% 的人群产生抑制物 血友病B 有5% 的人群产生抑制物
这也是我们把治疗的目光投在比蛋白替代法可能更优越 的基因治疗的原因之一！
输血减少 50% 输血减少 80% 没有变化
2）2003年，以AAV-2/hFIX介导的直 接肌肉注射，基因治疗血友病B方案 已被批准临床试验（国家药品监督管 理局药物临床批件，2003L00403）
重组AAV载体
ITR CMV
hFIX minigene
PA ITR
pAVChFIXm
ITR CMV ITR CMV
0天 3天 15天 27天 39天 阳性对照
采用Western dot-blot分析表明，于肌 肉注射rAAV/hFIX病毒子后第15天，小鼠 血液中即开始出现抗hFIX抗体，血浆中 hFIX水平亦开始下降. 经Bethesda分析,未发现抗小鼠IX因子抗 体.
抗AAV抗体检测
中和抗体(倍数)
10
血友病 Bห้องสมุดไป่ตู้基因治疗动物实验比较
单位
载体
基因
启动子
动 物 模 型 FIX 表 达 持 续 时 间
FIX:Ag FIX:C (ng/ml) ( %)
症状
复 旦 大 学 AAV hFIXm
复 旦 大 学 AAV hFIXm R338A
复 旦 大 学 AAV mFIX
宾 州 大 学 AAV hFIX
宾 州 大 学 AAV cFIX
因此，肝细胞不一定是血友病基因治 疗必然的靶细胞。
1）1991年，复旦大学反转录病毒
介导的ex vivo途径临床试验取得
了安全有效的结果
反转录病毒载体
5‘LTR FIX cDNA
Neo S Ori P Ori 3’LTR
XL－IX
5‘LTR
Neo
CMV FIX cDNA
3’LTR
N2CMV－IX
肝脏输注
250 482 550
70 1800 <95
6.0
27 天 出 血 减 少
34.2 >13 周 凝 血 正 常
27.5 >350 天 凝 血 正 常
5-7
>1 年
无法观察
1.4
2.5 年 凝 血 时 间 缩 短
25 >17 月 纠 正 出 血 症 状
1% >240 天 部 分 纠 正
3）以其他载体系统进行血友病B基因治疗
hFIX血浆表达量
800
700
600
500
400
300
200
100
0
293T
L-02
BHK
细胞类型
FUXW FAXW
重组慢病毒载体 FUXW FAXW感染离体细胞 293T 、L-02、 BHK 72h后的hFIX蛋白表达
ABP肝特异性启 动子指导人的凝 血因子IX的重组 HIV载体：重组慢 病毒载体质 FUXW,FAXWD等
血友病 B 基因治疗临床试验比较
患者 单位 载体 基因 启动子 靶细胞组织 治疗策略 FIX:C(%) 临床症状
治疗前 治疗后
LD 复旦 RV hFIX LTR 成纤维细胞 ex vivo 2.2 5.9 出血,输血减少 LW 复旦 RV hFIX LTR 成纤维细胞 ex vivo 2.4 4.1 输血量减少 ZL 复旦 RV hFIX CMV 成纤维细胞 ex vivo 1.8 4.1 按鼻止血;出
早期期望值过高，目前理论研究和技 术的发展水平均还不能满足成功临床试 验的需要，安全性问题还一直没有彻底 解决。然而，目前对许多疾病分子机制 和对基因载体的研究取得了长足的进步， 为基因治疗较大范围临床试验开展打下 了坚实的基础。
选择
•在治疗上合适的基因——已知其在某 特定疾病中的病理、生理作用
•微小腺病毒载体介导hFIX小基因离体表达
ªÑ ¬½ ÐÖ FIX¬º ¿Á (ng/ml)
800 700 600 500 400 300 200 100
0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 4 5 6 7 8 9 10 11
ÜÖ
miniAdcFIX AdcFIX control
ELISA方法检测微小腺病毒(miniAd)及第一代腺病毒(firstAd)介导cFIX在血友病B小 鼠血浆中的表达
mFIX
PA ITR
pAVCmFIX
hFIX R338A
PA ITR
pAVChFIXmR
Transient Expression of pAAV-hFIXs in Cell Lines