免疫功能分析
细 胞 膜 抗 原 标 记
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细胞固定 和膜通透
检测细胞内的细胞因子表达，细 胞必须在穿透细胞膜前被固定， 以维持细胞的结构完整性； 细胞固定选用paraformaldehyde: 含4%(w/v)paraformaldehyde的 中性pH缓冲液(Dulbeccos’ PBS) 细胞穿透选用去污剂saponin 应用抗体标记的缓冲液含代谢抑 制剂叠氮钠(0.09%w/v)，抑制抗 体结合引起的细胞膜蛋白的再分 布
单核细胞细胞内细胞因子分析
LPS是单核细胞的 特异刺激剂 LPS刺激4小时全血 选定CD14-的淋巴 细胞群和CD14+的 单核细胞群 只有CD14+单核细 胞群表达细胞因子 TNF-
完整细胞和膜通透细胞对 细胞膜抗体标记的影响
全血和外周血单个核细胞比较
单核细胞产生细胞因子图谱
细胞内细胞因子
细胞因子决定免疫效应细胞的构成和形成 介导免疫功能的转化(保护性免疫和对病原 体的炎症反应) 任何异常调节形式将导致免疫病理状态： 免疫缺陷或自身免疫 在健康和疾病中起非常重要作用，是临床 和基础研究的重点
流式细胞术分析细胞内因子的优势
在单个细胞水平分析细 胞因子的表达； 多参数分析确定细胞活 化状态、细胞系及亚型、 与其他细胞、组织结合 能力； 作用类型：autocrine, paracrine, or juxtacrine； 混合细胞群中分析特定 细胞类型
PMA和Ionomycin刺激4小时Paraformaldehyde固定、 Saponin膜穿透、GolgiStop阻断
此患者的CD4+T淋巴细胞以Th1为主
特定细胞亚群的功能状 态与某些疾病过程关系
两例HIV阳性患者CD4+T 细胞亚群对刺激反应存在 差异 #13患者CD4+和CD8+细胞 对PMA刺激的反应强与#1 患者 #13患者在观察的5个月病 情稳定 #1患者则很快恶化死亡
红色为CD123+DC、绿色为CD11c+DC、蓝色为嗜碱细胞
注意事项：
细胞的穿透：未使用含穿透剂的溶液稀释抗体， 降低细胞膜通透性结合抗体减少； 蛋白分泌的抑制：细胞激活过程未用蛋白转移抑 制剂，细胞因子不能在细胞内蓄积； 细胞内标记前细胞的固定：细胞内标记前没有固 定，含有Saponin的缓冲液导致细胞裂解和死亡； 适当的细胞活化体系： 非特异染色：FcR结合；抗体浓度过高。
超级抗原活化T细胞的机制
超级抗原即来自各种病毒和细 菌病原体的蛋白通过TCR-V 与APC细胞的HLA II类分子 相互作用刺激T细胞； 与处理过的抗原识别TCR-V 和TCR-V链不同，超级抗原 活化人类T细胞中表达TCRV T细胞； 链球菌内毒素(SEB)仅与TCRV6反应而不与TCR-V8作用
NK细胞和B淋巴细胞亚群
Th和Ts细胞亚群早期活化细胞
Th和Ts细胞亚群中期活化细胞
Th和Ts细胞亚群辅助因子表达
CD28信号： 仅仅TCR复合物与MHC复 合物相互作用不能诱导T细 胞活化，导致细胞长期低反 应性、无能或细胞死亡； 共刺激分子如CD28通过与 APC细胞上的CD80/B7.1 和CD86/B7.2相互作用， 与TCR复合物共同诱导T细 胞增殖、上调细胞因子及细 胞因子受体的表达、上调涉 及T细胞生存因子如Bcl-xL。
树突状细胞(dendritic cell, DC)是 抗原摄取、处理和递呈给T淋巴细 胞的专职抗原递呈细胞。 缺乏淋巴细胞、单核细胞、粒细 胞的系特异性标记(Lin-)； 表达CD83和CMRF-44细胞膜标志； CD123、CD11c或HLA-DR
DC定义为R3区、R4区及R5区
外周血DC局限于R7=R1 and R2 (R3 or R4 or R5)；
细胞内细胞因子检测
Brefedlin A(BFA)在细胞被激活4小 时内阻止细胞内合成蛋白质转运， 使产生细胞因子滞留于细胞内 荧光素结合的抗体标记细胞膜标记 裂解红细胞、固定白细胞、细胞膜 穿透、荧光素结合细胞因子抗体标 记细胞，洗涤细胞 流式细胞仪分析
T淋巴细胞内细胞因子的表达
对照的设置
细胞固定和膜穿透 后，应用同一克隆 的无荧光素结合抗 体处理，能够区分 细胞因子特异和非 特异染色
应用重组细胞因子 蛋白预处理阻断荧 光标记抗体结合， 区分特异荧光和非 特异荧光标记； 某些重组细胞因子 反而增加非特异背 景信号；
阴性对照和阳 性细胞对照
荧光素结合的Isotype Ig作为阴性对照，阴 性对照的抗体浓度应 该与抗细胞因子抗体 的浓度相同； 细胞内细胞因子阳性 对照细胞：检测操作 过程和抗体的特异性； 抗体浓度的确定
细胞经过固定和膜 通透后，荧光标记 的进入细胞内，到 达Golgi与细胞因子 结合； 目前已有多种形式 的荧光标记的细胞 因子抗体，包括 FITC、PE、PerCP、 APC等用于流式细 胞术多参数分析
荧光素和抗体滴度
荧光素增加；弱信号采 用PE或APC，强信 号采用FITC； 由于荧光素结合抗体 容易产生高水平的非 特异背景信号，最好 预先测定最佳抗体浓 度，否则存在假阳性
细胞因子的产生是 伴随细胞活化过程 产生的，如图； 多数情况下，未刺 激的白细胞产生很 少或难以检测到的 细胞因子，必须以 一定的方式体外活 化刺激细胞因子的 产生；
诱导细胞因子产生的条件
有多种活化因子能够 诱导大量的细胞因子 产生细胞，应用于流 式细胞术分析； 蛋白转运抑制剂能够 增加细胞内细胞因子 的蓄积，便于对细胞 因子产生细胞的检测
上图：IL-1 FITC/IL1a PE/CD14 PerCP/ TNF APC； 中图： IL-1 FITC/ IL-1 PE/CD14 PerCP /TNF APC； 下图： IL-8 FITC /IL-6 PE/CD14 PerCP /TNF APC；
外周血树突状细胞
CD45RA是表达外显子B的CD45家族，CD45不同 异型体存在于不同功能T细胞组份中，是既是重要 的粘附分子又是T细胞重要的发育阶段标志，处女 型或静止型T细胞表达CD45RA抗原
Fas/APO-1为跨膜蛋白，属于TNF超家族，介导细 胞凋亡，CD95在 多数外周血CD4+T细胞和CD8+T 淋巴细胞亚群表达，在活化的T细胞显著上调。
免疫功能分析
淋巴细胞成分及功能
T细胞活化动力学
流式细胞术 多参数分析
多参数分析的最大的优势 是能够在混合细胞群中对 特定细胞亚群进行分析； 如全血细胞的三色分析， CD3-PerCP选定CD3+细 胞群，分析CD4+细胞 CD69活化可以的表达；
淋巴细胞群的确定
淋巴细胞亚群的分布
T淋巴细胞的Th和Ts细胞亚群
不同蛋白转运抑制剂对细胞因子产 生细胞检测的影响
应用PMA和Ionomycin刺激； GolgiPlug或GolgiStop阻断蛋白转 运； TNF、IL-4抗体标记细胞内因子； GolgiPlug能够增强TNF的检测； GolgiStop增加IL-4的检测信号； 两者均不增加自发荧光信号；
Th1/Th2细胞的检测及应用
新的Th1/Th2模型包括： 一系列表达细胞因子的特定细 胞群：T、B、NK和单核巨噬 细胞系统； I型细胞涉及细胞介导的免疫反 应，迟发过敏反应、巨噬细胞 活化、下调II型反应，病毒、 某些细菌刺激； II型细胞涉及体液免疫反应，B 细胞增生、多克隆Ig分泌、下 调I型反应，原虫、过敏原刺激。
蛋白转运抑制剂的作用机制
GolgiPlug，monensin 为一种离子载体，阻 断离子跨膜梯度转移； Brefedlin A，是真菌 代谢产物干扰从粗面 内质网到Golgi复合物 的管道转运
A GolgiPlug、B GolgiStop C 无蛋白转运阻止剂
FcR阻断
对于小鼠细胞需要用 于FcR阻断剂(纯化的 抗FcII/III受体抗体) 减少非特异性荧光染 色； 对于人和兔细胞可以 应用纯化同种的Ig或 血清预先阻断Fc受体
IL-2是T细胞产生和分泌 的细胞因子，诱导IL-2分 泌是T细胞活化的第一步； IL-2又是活化T细胞的重 要自分泌生长因子，是 产生细胞毒T细胞所必需 的； Th1型CD4+T细胞主要产 生IL-2和INF-，Th2型 CD4+T细胞则产生IL-4和 IL-10
Th1和Th2细胞
病毒感染患者的外周血 +细胞亚群 Th1/Th2 CD4
