浙江农业学报ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＺｈｅｊｉａｎｇｅｎｓｉｓꎬ２０１９ꎬ３１(１):９８－１０３ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｚｊｎｙｘｂ.ｃｎ陈炫ꎬ张天烨ꎬ羊健ꎬ等.小麦ＴａｅＥＦ１β基因的克隆、同源性及表达分析[Ｊ].浙江农业学报ꎬ２０１９ꎬ３１(１):９８－１０３.
ＤＯＩ:１０３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００４￣１５２４２０１９０１１３
收稿日期:２０１８￣０３￣２５基金项目:国家自然科学基金(３１５０１６０)ꎻ国家农业产业体系(ＣＡＲＳ￣３￣１)ꎻ国家小麦转基因专项(２０１６ＺＸ０８００２００１)作者简介:陈炫(１９９２—)ꎬ女ꎬ陕西咸阳人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事植物病理学研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｖｉｖｉａｎｃｃｘ＠１６３.ｃｏｍ∗通信作者ꎬ陈剑平ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｊｐｃｈｅｎ２００１＠１２６.ｃｏｍ
小麦ＴａｅＥＦ１β基因的克隆、同源性及表达分析陈 炫１ꎬ张天烨１ꎬ羊 健２ꎬ张恒木２ꎬ陈剑平２ꎬ∗(１.浙江农林大学林业与生物技术学院ꎬ浙江杭州３１１３００ꎻ２.浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所ꎬ浙江杭州３１００２１)
摘 要:真核翻译延伸因子(ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎬｅＥＦｓ)是一种重要的多功能调控蛋白ꎬｅＥＦ１β是ｅＥＦ１的组成部分ꎬ在蛋白质生物合成过程中发挥着重要的作用ꎮ本文通过ＲＴ￣ＰＣＲ扩增克隆小麦
(ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ.)的ｅＥＦ１β基因ꎬ并命名为ＴａｅＥＦ１βꎮ氨基酸同源性分析发现ꎬＴａｅＥＦ１β具有高度保守
性ꎬ且其保守结构域位于１３７~２２６ａａ处ꎮｑＲＴ￣ＰＣＲ结果表明ꎬ中国小麦花叶病毒(Ｃｈｉｎｅｓｅｗｈｅａｔｍｏｓａｉｃｖｉ￣ｒｕｓꎬＣＷＭＶ)侵染小麦植株后ꎬ可以诱导ＴａｅＥＦ１β基因转录水平的上调表达ꎮ另外ꎬ本文也进一步分析了
ＴａｅＥＦ１β基因在小麦根、茎、叶的表达水平和ＣＷＭＶ侵染不同时间点的表达情况ꎮ关键词:真核翻译延伸因子ꎻ中国小麦花叶病毒ꎻ同源性分析中图分类号:Ｓ４３５１２文献标志码:Ａ文章编号:１００４￣１５２４(２０１９)０１￣００９８￣０６
ＧｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇꎬｈｏｍｏｌｏｇｙａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＴａｅＥＦ１βｉｎＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ.ＣＨＥＮＸｕａｎ１ꎬＺＨＡＮＧＴｉａｎｙｅ１ꎬＹＡＮＧＪｉａｎ２ꎬＺＨＡＮＧＨｅｎｇｍｕ２ꎬＣＨＥＮＪｉａｎｐｉｎｇ２ꎬ∗
(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＺｈｅｊｉａｎｇＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨａｎｇｚｈｏｕ３１１３００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｉｒｏｌｏ￣ｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＺｈｅｊｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＨａｎｇｚｈｏｕ３１００２１ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ(ｅＥＦｓ)ｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｒｏｔｅｉｎ.ｅＥＦ１βｗａｓｓｕｂ￣ｕｎｉｔｏｆｔｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ￣１(ｅＥＦｓ￣１)ｃｏｍｐｌｅｘａｎｄｐｌａｙｅｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｐｒｏｔｅｉｎｂｉｏ￣ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ.ＴｈｅｅＥＦ１βｇｅｎｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｃｌｏｎｉｎｇｗｉｔｈＲＴ￣ＰＣＲｆｒｏｍｗｈｅａｔａｎｄｎａｍｅｄａｓＴａｅＥＦ１β.ＴｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＴａｅＥＦ１βｗｅｒｅｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｎｄｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎｗａｓｌｏｃａｔｅｄｉｎ１３７￣２２６ａａ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｑＲＴ￣ＰＣＲｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＴａｅＥＦ１βｗｅｒｅｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｔｈｅＣＷＭＶ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄｐｌａｎｔｓ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴａｅＥＦ１βｉｎｔｈｅｓｔｅｍｓꎬｌｅａｖｅｓａｎｄｒｏｏｔｓｏｆｗｈｅａｔａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｇｅｓｏｆＣＷＭＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗａｓａｌｓｏｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｑＲＴ￣ＰＣＲ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎻＣｈｉｎｅｓｅｗｈｅａｔｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎻｈｏｍｏｌｏｇｙａｎａｌｙｓｉｓ
真核翻译延伸因子(ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅ￣ｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎬｅＥＦｓ)最早作为一个对噬菌体Ｑβ的依赖于ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶(ＲＮＡ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅꎬＲｄＲｐ)活性具有重要作用的辅助因子被发现并鉴定[１]ꎮ在真核细胞中包括３类延伸因子ꎬ分别为ｅＥＦ１α(ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ１α)、ｅＥＦ１β和ｅＥＦ２[２]ꎮＥＦ１β在
真核生物中的结构比在细菌中更复杂ꎬ该蛋白由ＥＦ１β￣ａｌｐｈａ、ＥＦ１β￣ｇａｍｍａ和ＥＦ１β￣ｂｅｔａ三个亚基
组成ꎮ在蛋白质的合成过程中ꎬｅＥＦ１β主要作为ＥＦ家族的一种核苷酸交换因子ꎬ催化不活跃的ｅＥＦ１αＧＤＰ重新变成具有活性的ｅＥＦ１αＧＴＰ[３]ꎮ 近年来ꎬ越来越多的证据表明ꎬｅＥＦｓ作为蛋白分子伴侣和ＲＮＡ/ａｃｔｉｎ结合蛋白参与病毒的转录、翻译、组装及其致病机理的过程[４－９]ꎮ已经报道的有ｅＥＦ１α在番茄花叶病毒(Ｔｏｍａｔｏｍｏ￣ｓａｉｃｖｉｒｕｓꎬＴｏＭＶ)[１０]和番茄丛矮病毒(ＴｏｍａｔｏｂｕｓｈｙｓｔｕｎｔｖｉｒｕｓꎬＴＢＳＶ)[１１]中促进病毒复制复合体的形成ꎻ在人类免疫缺陷病毒１型(ＨＩＶ￣１)病毒中促进病毒粒子的组装[１９]ꎻ在乙型肝炎病毒(ｈｅｐ￣ａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓꎬＨＢＶ)中作为Ｘ蛋白的分子伴侣[１２]ꎻｅＥＦ１β与烟草花叶病毒(ＴｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎬＴＭＶ)的ＲｄＲｐ互作影响其病毒的复制[１３]等ꎮ中国小麦花叶病毒(Ｃｈｉｎｅｓｅｗｈｅａｔｍｏｓａｉｃｖｉ￣ｒｕｓꎬＣＷＭＶ)是本实验室于２０世纪末在我国山东冬小麦上鉴定的一种由禾谷多黏菌(Ｐｏｌｙｍｙｘａｇｒａｍｉｎｉｓ)传播的病毒[１４]ꎮＣＷＭＶ为单链正义ＲＮＡ病毒(ｐｏｓｉｔｉｖｅ￣ｓｅｎｓｅｓｉｎｇｌｅ￣ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡｖｉ￣ｒｕｓꎬ(＋)ｓｓＲＮＡｖｉｒｕｓ)ꎬ包含两条基因组分别命名为ＲＮＡ１和ＲＮＡ２ꎮＲＮＡ１含有３个开放阅读框(ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅꎬＯＲＦ)ꎬ其中ＯＲＦ１编码一个１４９~１５３ｋｕ的多肽ꎬ其ＵＧＡ终止密码子能以一定比例通读(ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈꎬＲＴ)而使开放阅读框延伸至ＯＲＦ２ꎬ产生一个ＲＮＡ依赖性ＲＮＡ聚合酶(ＲｄＲＰ)ꎮＯＲＦ３编码一个３６~３７ｋｕ的运动蛋白(ｍｏｖｅｍｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎꎬＭＰ)[１５]ꎮＲＮＡ２含有３个ＯＲＦꎬ分别编码１９ｋｕ的ＣＰ蛋白、８４ｋｕ的外壳蛋白基因通读区(ＣＰ￣ＲＴ)蛋白、２５ｋｕ的蛋白质(Ｎ￣ＣＰ)和１８~１９ｋｕ的沉默抑制子蛋白[１６]ꎮ前期本实验室通过蛋白质组学分析发现ꎬＣＷＭＶ侵染小麦初期能够诱导ＴａｅＥＦ１β在蛋白质水平的上调表达(数据待发表)ꎬ据此ꎬ推测ＴａｅＥＦ１β可能通过某种途径参与病毒侵染寄主植物的过程ꎮ本研究首先用ＲＴ￣ＰＣＲ从小麦(Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓ￣ｔｉｖｕｍＬ.)中克隆ＴａｅＥＦ１β基因ꎬ并对其进行生物信息学分析ꎬ并采用ｑＲＴ￣ＰＣＲ分析ＴａｅＥＦ１β在小麦根、茎、叶等不同组织部位和ＣＷＭＶ不同侵染时期的转录表达水平ꎬ为进一步研究ＴａｅＥＦ１β对ＣＷＭＶ的影响机制提供依据ꎮ１ 材料与方法１.１ 材料本实验所用小麦烟农２２由山东省烟台市农业科学研究院提供ꎬ并由本实验室于温室内培养ꎮ大肠埃希菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｉｌ)感受态细胞Ｔｒａｎｓ５α购于北京全式金生物技术有限公司ꎻ基
因克隆所使用的反转录试剂盒ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ购于ＴＯＹＯＢＯ公司ꎻＥｘＴａｑ酶购于
ＴａＫａＲａ公司ꎻ限制性内切酶购于ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ(ＮＥＢ)公司ꎻ实时荧光定量ＰＣＲ(ｑｕａｎｔｉｔａ￣ｔｉｖｅｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲꎬｑＲＴ￣ＰＣＲ)所用的反转录试剂
盒ＨｉＳｃｒｉｐｔＱＲＴＳｕｐｅｒＭｉｘｆｏｒｑＰＣＲ与ＣｈａｍＱＵ￣ｎｉｖｅｒｓａｌＳＹＢＲｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ购于南京诺唯赞
生物科技公司ꎻ凝胶回收ＧｅｎｅＪＥＴＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ购于ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司ꎻ引物由杭州擎科
梓熙生物技术有限公司合成ꎮ１.２ 总ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ合成
总ＲＮＡ的提取:取健康小麦叶片０７５ｇꎬ使用液氮进行研磨后装入１５ｍＬＲＮａｓｅｆｒｅｅＥＰ管(以下步骤均使用ＲＮａｓｅｆｒｅｅＥＰ管)ꎻ按照１ｇ
ｍＬ－１
的量加入７５０μＬＴＲＩｚｏｌꎬ涡旋振荡混匀后于
４℃ꎬ１４０００ｒｍｉｎ－１ꎬ离心１０ｍｉｎꎻ小心吸取上清
到新的ＥＰ管中ꎬ按每１ｍＬＴＲＩｚｏｌ加入２００μＬ氯仿ꎬ涡旋振荡混匀后于室温静置１０ｍｉｎꎬ４℃ꎬ１４０００ｒｍｉｎ－１ꎬ离心１０ｍｉｎꎻ吸取上清无色水相ꎬ
按每１ｍＬＴＲＩｚｏｌ加入６００μＬ异戊醇ꎬ涡旋振荡混匀后于室温静置１０ｍｉｎꎬ４℃ꎬ１４０００ｒｍｉｎ－１ꎬ
离心１０ｍｉｎꎻ弃上清后ꎬ用预冷的无水乙醇悬浮沉淀(ＲＮＡ)后于４℃ꎬ１４０００ｒｍｉｎ－１ꎬ离心
１０ｍｉｎ(重复该步骤一次)ꎻ对ＲＮＡ进行微干燥
后ꎬ使用３０~５０μＬＤＥＰＣ水进行溶解ꎬ用ＲＮＡ琼脂糖凝胶电泳和ＮａｎｏＤｒｏｐＯｎｅ对ＲＮＡ的完整性、浓度和纯度进行检测ꎬ于－８０℃保存ꎮｃＤＮＡ合成:取总ＲＮＡ１μｇꎬ以随机引物为
反转录引物ꎬ采用ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ进行反转录ꎬ反应液配置及反应体系参照试剂盒说明书ꎬ进行反转录获得小麦ｃＤＮＡꎬ以０１×ｃＤ￣ＮＡ为ＰＣＲ扩增模板ꎮ
１.３ ｑＲＴ￣ＰＣＲ
根据ＮＣＢＩ数据库中小麦ｅＥＦ１β序列(登录号:ＡＫ３３２５２９１)ꎬ设计小麦基因ＴａｅＥＦ１β的ＰＣＲ引物(表１)ꎮ使用诺唯赞公司的ＳＹＢＲ在荧
光定量仪ＰＣＲ￣７９００(ＡＢＩ)上进行ｑＲＴ￣ＰＣＲ反应ꎬ
９９陈炫ꎬ等.小麦ＴａｅＥＦ１β基因的克隆、同源性及表达分析