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膀胱脱细胞基质预凝胶水溶液的微流变特性研究

膀胱脱细胞基质预凝胶水溶液的微流变特性研究刘文景1ꎬ范苏娜1ꎬ张慧慧1ꎬ邵惠丽1ꎬ宋鲁杰2ꎬ黄建文2ꎬ张耀鹏1∗(1.纤维材料改性国家重点实验室ꎬ东华大学材料科学与工程学院ꎬ上海㊀201620ꎻ2.上海交通大学附属第六人民医院泌尿外科ꎬ上海㊀200233)㊀㊀摘㊀要:本研究采用光学微流变仪对不同浓度膀胱脱细胞基质(BAM)预凝胶水溶液的动态成胶过程进行考察ꎮ结果表明ꎬ在BAM水凝胶成胶过程中ꎬ颗粒均方位移(MSD)曲线均出现平台区ꎬ且流动因子(FI)逐渐减小ꎬ即发生溶胶凝胶转变ꎻ随着BAM浓度的增加ꎬMSD曲线平台区高度降低且向右移动ꎬ宏观黏度因子(MVI)和弹性因子(EI)逐渐增大ꎬ网格尺寸(ξ)减小ꎬ即凝胶粘弹性增强ꎮ本研究为组织工程应用中原位注射BAM水凝胶提供了流变学参考ꎮ关键词:膀胱脱细胞基质㊀水凝胶㊀微流变性能㊀溶胶-凝胶转变中图分类号:TQ322.4㊀㊀㊀㊀㊀文献标识码:A㊀㊀㊀㊀㊀文章编号:1006334X(2019)01001105基金项目:国家重点研发计划ꎬ2018YFC1105802ꎻ国家自然科学基金ꎬ21674018ꎬ81600524ꎮ作者简介:刘文景(1994-)ꎬ安徽南陵人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为生物质材料的加工和制备ꎮ∗通讯作者:张耀鹏ꎬzyp@dhu.edu.cnꎮ㊀㊀BAM水凝胶作为一种源于膀胱组织的细胞外基质(ECM)水凝胶ꎬ具有良好的组织工程应用潜力ꎬ有望用于不规则形状缺陷组织的修复ꎮBAM水凝胶的流变学性能对其组织工程中的可注射应用有较大影响ꎬ因此对于其流变学性能的研究很有必要ꎮ目前ꎬ研究水凝胶流变性能最常用的方法是旋转流变学[12]ꎬ但测量过程存在较多局限ꎮ微流变学是一种在微米尺度下研究悬浮液㊁料浆以及凝胶等软物质粘弹性质的流变学方法[35]ꎮ基于动态激光光散射技术[6]ꎬ通过追踪体系中示踪粒子的布朗运动来表征样品粘弹性的变化ꎮ与传统的旋转流变测试相比ꎬ微流变测试能有效避免外部其他条件的干扰ꎬ可原位测定水凝胶的成胶过程和粘弹性能ꎮ本文采用光学微流变仪对BAM水凝胶的成胶过程进行全面评价ꎬ研究浓度对BAM水凝胶粘弹性能㊁内部网格尺寸的影响ꎬ为组织工程应用过程中原位注射BAM水凝胶的应用提供流变学参考ꎮ1㊀试㊀验1.1㊀原料及试剂新鲜猪膀胱ꎬ自购ꎻ聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX100)ꎬ美国Sigma公司ꎻ氨水ꎬ分析纯ꎬ国药集团化学试剂有限公司ꎻ胃蛋白酶ꎬ美国Sigma公司ꎻ盐酸ꎬ分析纯ꎬ平湖化工ꎻ氢氧化钠ꎬ分析纯ꎬ上海凌峰ꎻ磷酸缓冲生理盐水试剂ꎬ杭州吉诺ꎻ磷酸缓冲生理盐水溶液ꎬ规格10ˑPBSꎬ上海翊圣ꎻ去离子水ꎬ实验室自制ꎮ1.2㊀仪器设备光学微流变仪:RheolaserMaster型ꎬ法国For ̄mulaction公司ꎻ电子分析天平:HANGPINGFA2104型ꎬ上海精密仪器公司ꎻ恒温摇床:HS200B型ꎬ上海和呈仪器公司ꎻ冷冻干燥机器:FD1A50型ꎬ北京博医康公司ꎻ冷冻研磨机:FREEZER/MILL6770型ꎬ美国SPEXSamplePrep公司ꎻ离心管:50mLꎬ合肥新恩源公司ꎮ1.3㊀猪膀胱脱细胞处理将猪膀胱粘膜进行脱细胞处理[7]ꎬ简要步骤如下:首先将新鲜猪膀胱组织清洗后剔除肌层和浆膜层ꎬ剩余粘膜层和粘膜下层ꎬ继续置于去离子水中震荡48hꎮ再将其置于体积分数0.5%的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX100)和0.1%氨水组成的脱细胞液中处理2周ꎬ每2~3天更换新脱细胞液ꎬ完成后在去离子水中继续清洗24hꎬ得到脱细胞BAM片层ꎮ最后将清洗后的BAM置于体积分数75%乙醇中备用ꎮ1.4㊀BAM预凝胶溶液的制备经去离子水洗净的BAM片经冷冻干燥㊁冷冻研第34卷第1期2019年3月合成技术及应用SYNTHETICTECHNOLOGYANDAPPLICATIONVol.34㊀No.1Mar.2019磨制得BAM粉末ꎮ将100mgBAM粉末与10mg胃蛋白酶置于10mL盐酸溶液(0.01M)中ꎬ置于25ħ恒温摇床上消化48h后得到BAM消化液ꎬ转速设置为150r/minꎮ然后加入1/10消化液体积的NaOH溶液(0.1M)和1/9消化液体积的10ˑPBS中和ꎬ最后用PBS稀释即可得到不同浓度的BAM预凝胶溶液(4㊁6㊁8mg/mL)ꎬ分别记为BAM4ꎬBAM6和BAM8ꎮ具体制备过程参考文献[8]ꎮ1.5㊀BAM水凝胶成胶过程的微流变测定采用RheolaserMaster光学微流变仪对BAM水凝胶成胶过程的微流变性能进行分析ꎮ该仪器以多散斑扩散波光谱学理论为基础[9]ꎬ使用可视照相机记录因示踪粒子布朗运动而导致的光散斑图像变化ꎬ定量表征散斑图像的变形速率ꎬ进一步得到示踪粒子的均方根位移(MSD)与去相关时间(tdec)的曲线ꎬ即MSD曲线ꎮ测试过程中ꎬ取3.6mL的待测样品于4mL的样品池中ꎬ并向待测样品中加入50μL乳液ꎬ乳液中乳胶颗粒的半径为0.5μmꎬ摇晃使颗粒均匀分散ꎮ设置测试时间为1hꎬ测试温度为37ħꎮ根据样品中示踪粒子的MSD曲线推出流动因子(FI)㊁弹性因子(EI)㊁宏观粘度因子(MVI)以及网格尺寸(ξ)等参数[10]ꎮ2㊀结果与讨论2.1㊀BAM水凝胶成胶过程中的MSD曲线图1是BAM4在不同时间点所得的MSD曲线ꎮ图1㊀BAM-4在成胶过程中不同时间处的MSD曲线由图1可知ꎬ在测试时间为2ᶄ56ᵡ时ꎬ样品的MSD曲线为线性增长ꎬ这表明颗粒在样品中做自由布朗运动ꎬ其运动不受限制ꎬ样品表现为纯粘性流体ꎮ在测试时间为9ᶄ8ᵡ时ꎬBAM4的MSD曲线出现平台区ꎬ这表明样品中颗粒的布朗运动受到限制ꎬ且主要是受样品弹性的影响ꎬ颗粒被困于三维凝胶网络结构中ꎬ运动速度减慢ꎬ导致MSD曲线斜率下降形成平台区ꎮ此时样品表现为粘弹性ꎬ即预凝胶溶液已经发生了溶胶凝胶转变ꎮ上述结果表明ꎬ在测试过程中ꎬ随着时间的增加ꎬBAM预凝胶溶液逐渐形成BAM水凝胶ꎮ为了比较不同浓度BAM水凝胶粘弹性能ꎬ选取不同浓度BAM水凝胶成胶后相似时间点的MSD曲线进行比较ꎬ如图2所示ꎮ图2㊀不同浓度BAM水凝胶在9ᶄ30ᵡ附近的MSD曲线BAM4:9ᶄ25ᵡꎻBAM6:9ᶄ41ᵡꎻBAM8:9ᶄ35ᵡ从图2中可以看出ꎬ随着BAM水凝胶浓度的增加ꎬ平台区高度降低ꎬ这说明颗粒运动受限越严重ꎬ弹性越强ꎻ此外ꎬ质量浓度越高ꎬMSD曲线越向右偏移ꎬ体系粘性越大ꎮ因此ꎬ随着浓度的增加ꎬBAM水凝胶的粘弹性都逐渐增加ꎮ2.2㊀BAM水凝胶成胶过程中的流动因子变化图3为不同浓度BAM水凝胶成胶过程中流动因子FI曲线ꎮ图3㊀BAM水凝胶成胶过程中流动因子曲线21合成技术及应用第34卷由图3可知ꎬ测试开始时ꎬ这三种BAM预凝胶溶液的FI均大于10-2Hzꎻ随着时间的增加ꎬFI逐渐减小ꎬ最后达到稳定平衡值ꎬ且均介于10-2~10-1Hz之间ꎬ并且存在FIBAM4>FIBAM6>FIBAM8ꎮFI是反映样品流动性能的参数ꎬ通常FI接近于10Hz时ꎬ样品呈现液体性质ꎻFI接近10-2Hz时ꎬ样品主要呈现固体性质ꎮ上述结果表明ꎬ三种预凝胶溶液测试前均呈现流动性很好的溶液态ꎻ随着时间增加ꎬ三种BAM预凝胶溶液都发生了溶胶凝胶转变ꎬ最终都表现为类固体性质ꎬ且浓度越高ꎬ固体性质越明显ꎮ2.3㊀BAM水凝胶成胶过程中的弹性因子变化图4为BAM水凝胶成胶过程中EI变化曲线ꎮEI被定义为MSD曲线平台区高度的倒数ꎬ是表征样品弹性的物理量ꎬ它与弹性模量Gᶄ相关联ꎮEI值越大ꎬGᶄ值越大ꎬ即样品弹性越大ꎮ对于凝胶样品ꎬEI与凝胶很多性质相关联ꎬ如凝胶内部网格尺寸㊁硬度以及剪切恢复等[11]ꎮ图4㊀BAM水凝胶成胶过程中弹性因子曲线从图4可以看出ꎬ这三种BAM水凝胶成胶过程中的EI曲线随着时间的增加逐渐增长ꎬ快速增加到一个平衡的稳定值后ꎬ几乎保持不变ꎬ表明体系的弹性逐渐增加至一个最大平衡值ꎮ这一S型的增长过程对应BAM预凝胶溶液向BAM水凝胶转变的凝胶化过程ꎮ此外ꎬ达到平衡值时ꎬEIBAM8>EIBAM6>EIBAM4ꎬ即浓度越大ꎬ成胶后水凝胶弹性越大ꎮECM水凝胶的形成是基于胶原蛋白分子的自组装过程[12]ꎮ根据上述EI曲线可以将BAM水凝胶的凝胶过程分为两个阶段ꎬ第一个阶段为快速增长阶段ꎬ即在反应开始时ꎬ溶液中的胶原蛋白分子数量很多ꎬ具有足够的机动性进行相互反应ꎬ交联位点较多ꎬ预凝胶溶液迅速发生溶胶凝胶转变形成弱凝胶ꎻ第二阶段是稳定后的平台区增长阶段ꎬ此阶段为弱凝胶完善阶段ꎬ体系中未交联的胶原蛋白分子较少ꎬ导致交联位点较少ꎬEI值增长缓慢ꎬ最终几乎不变ꎮ此外ꎬ上述结果还表明ꎬBAM浓度增加使胶原蛋白分子数量增加ꎬ交联位点增加ꎬ从而导致达到平衡稳定后的EI值也越大ꎮ2.4㊀BAM水凝胶成胶过程中宏观粘度因子变化图5为不同质量浓度BAM水凝胶成胶过程中MVI变化曲线ꎮMVI被定义为MSD曲线平台区后的斜率ꎬ是表征体系粘度的物理量ꎮ图5㊀BAM水凝胶成胶过程中宏观粘度因子曲线由图5可知ꎬ这三种水凝胶在成胶过程中ꎬMVI值逐渐增大ꎬ并且快速增加到一个平衡的稳定值ꎬ即体系的粘性逐渐增加至一个最大平衡值ꎮ这表明BAM水凝胶网络的形成会使体系粘度增加ꎮBAM6和BAM8的MVI值在达到平衡稳定值的过程中会出现一个数值略微下降的平台区ꎬ而BAM4的这一现象则并不明显ꎬ这可能是由于BAM预凝胶溶液成分较为复杂ꎬ导致其成胶过程的MVI值变化不稳定ꎬ且浓度越高ꎬ溶液稳定性越差ꎮ此外ꎬ随着BAM浓度的增加ꎬ平衡后的MVI值也逐渐增大ꎮ这是由于随着BAM浓度的增加ꎬ体系内胶原蛋白分子数增加ꎬ使得水凝胶交联网络结构中的节点增多ꎬ网络结构更紧密ꎬ体系中乳胶颗粒的运动因而受到阻碍ꎬ导致体系宏观黏度增大ꎮ这与上述EI变化曲线结果一致ꎮ2.5㊀BAM水凝胶的网格尺寸为了更加直观地表征BAM水凝胶凝胶化过程中网络结构的形成及尺寸变化ꎬ计算得到BAM水凝胶内部网格尺寸ξꎮ图6为BAM水凝胶成胶过程中ξ变化曲线ꎮ31第1期刘文景等.膀胱脱细胞基质预凝胶水溶液的微流变特性研究图6㊀BAM水凝胶成胶过程中凝胶网格尺寸曲线由图6可知ꎬ随着时间增加ꎬξ在初期阶段快速减小ꎬ最终减小至一个平衡稳定值ꎮ以上结果表明ξ与EI成反比增长关系ꎮ这是因为在成胶过程中水凝胶三维网络结构快速形成ꎬ且越来越紧密[13]ꎬξ变小ꎬ而凝胶弹性增大ꎮ此外ꎬ随着BAM浓度的增加ꎬ体系的ξ减小ꎮ这是由于BAM浓度越大ꎬ体系中胶原分子数量越多ꎬ交联位点越多ꎬ从而导致网络结构更加紧密ꎬξ越小ꎬ凝胶弹性也越强ꎮ3㊀结㊀论本研究借助光学微流变仪ꎬ采用一种原位测定的方法研究了BAM水凝胶体系的动态成胶过程ꎬ通过微流变学中的MSD曲线及相关参数分析可知:a)在37ħ下ꎬ随着时间增加ꎬBAM体系逐渐发生溶胶凝胶转变ꎬ体系的粘弹性增加ꎬ即从纯粘性液体转变成粘弹性水凝胶ꎮb)在成胶过程中ꎬMVI和EI值升高ꎬFI和网格尺寸ξ值降低ꎬ体系凝胶网络结构逐渐紧密ꎬ体系弹性和粘性都增加ꎮc)随着BAM水凝胶浓度的增加ꎬ体系中胶原分子数量增加ꎬ交联位点增加ꎬ从而导致网络结构更加紧密ꎬ达到平衡稳定后的MVI和EI值增加ꎬFI和ξ值减小ꎬ凝胶粘弹性越强ꎮ参考文献:[1]㊀AalaieJꎬVasheghani ̄FarahaniEꎬRahmatpourAꎬetal.Gelationrheologyandwaterabsorptionbehaviorofsemi ̄interpenetratingpolymernetworksofpolyacrylamideandcarboxymethylcellulose[J].JournalofMacromolecularScienceꎬPartBꎬ2013ꎬ52(4):604613.[2]㊀LucioBꎬdelaFuenteJL.Rheokineticanalysisontheformationofmetallo ̄polyurethanesbasedonhydroxyl ̄terminatedpolybuta ̄diene[J].EuropeanPolymerJournalꎬ2014ꎬ50:117126. [3]㊀ChenYQꎬChouPLꎬChengCYꎬetal.Microrheologyofhumansynovialfluidofarthritispatientsstudiedbydiffusingwavespec ̄troscopy[J].JournalofBiophotonicsꎬ2012ꎬ5(10):777784. [4]㊀LarsenTHꎬFurstEM.Microrheologyoftheliquid ̄solidtransi ̄tionduringgelation[J].PhysicalReviewLettersꎬ2008ꎬ100(14):146001.[5]㊀TisserandCꎬFleuryMꎬBrunelLꎬetal.Analyticalseriessoftmatteranalysisbymeansofmicrorheology[J].Coatingstechꎬ2012ꎬ9(3):4651.[6]㊀BellourMꎬSkouriMꎬMunchJPꎬetal.Brownianmotionofparti ̄clesembeddedinasolutionofgiantmicelles[J].TheEuropeanPhysicalJournalE ̄SoftMatterꎬ2002ꎬ8(4):431436. [7]㊀FengCꎬXuYMꎬFuQꎬetal.Evaluationofthebiocompatibilityandmechanicalpropertiesofnaturallyderivedandsyntheticscaf ̄foldsforurethralreconstruction[J].JournalofBiomedicalMateri ̄alsResearchPartAꎬ2010ꎬ94a(1):317325. [8]㊀FreytesDOꎬMartinJꎬVelankarSSꎬetal.Preparationandrheo ̄logicalcharacterizationofagelformoftheporcineurinarybladdermatrix[J].Biomaterialsꎬ2008ꎬ29(11):16301637. [9]㊀TisserandCꎬFleuryMꎬBrunelLꎬetal.Passivemicrorheologyformeasurementoftheconcentrateddispersionsstability[J].Pro ̄gressinColloid&PolymerScienceꎬ2012ꎬ139:101105. [10]ChenYQꎬChengCYꎬChiangCCꎬetal.Microrheologyofsodi ̄umpolystyrenesulfonate(NaPSS)solutionswithdifferentpolymerconcentrationsandmolecularweightsstudiedbydiffusingwavespectroscopy[C].HolographyꎬDiffractiveOpticsꎬandApplica ̄tionsIV.InternationalSocietyforOpticsandPhotonicsꎬ2010ꎬ7848:78480H.[11]MinWꎬYangXQ.Effectsofmolecularweightofdextranontherheologicalbehaviorandtexturepropertiesofsoyproteinisolatecold ̄setgels[J].Science&TechnologyofFoodIndustryꎬ2010ꎬ31(5):7271.[12]BrightmanAOꎬRajwaBPꎬSturgisJEꎬetal.Time ̄lapseconfo ̄calreflectionmicroscopyofcollagenfibrillogenesisandextracellu ̄larmatrixassemblyinvitro[J].Biopolymersꎬ2000ꎬ54(3):222234.[13]OelschlaegerCꎬSchopfererMꎬScheffoldFꎬetal.Linear ̄to ̄branchedmicellestransition:Arheometryanddiffusingwavespec ̄troscopy(DWS)study[J].Langmuirꎬ2009ꎬ25(2):716723.41合成技术及应用第34卷MicrorheologicalpropertiesofbladderacellularmatrixhydrogelduringgelationLiuWenjing1ꎬFanSuna1ꎬZhangHuihui1ꎬShaoHuili1ꎬSongLujie2ꎬHuangJianwen2ꎬZhangYaopeng1∗(1.StateKeyLaboratoryforModificationofChemicalFibersandPolymerMaterialsꎬCollegeofMaterialsScienceandEngineeringꎬDonghuaUniversityꎬShanghai201620ꎬChinaꎻ2.DepartmentofUrologyꎬShanghaiJiaoTongUniversityAffiliatedSixthPeople sHospitalꎬShanghai200233ꎬChina)Abstract:Inthisstudyꎬthemicrorheologicalpropertiesofbladderacellularmatrix(BAM)pre ̄gelsolutionswithdifferentmassconcentrationswereinvestigatedduringgelationbyopticalmicrorheometer.Resultsshowedthatthemeansquaredisplacement(MSD)ofallBAMpre ̄gelsolutiongeneratedaplateauregionandthefluidityindex(FI)graduallydecreased.FurthermoreꎬastheBAMconcentrationincreasedꎬtheplatformheightofMSDcurvesdecreasedꎬandthecurvesshiftedtoright.Themacroscopicviscosityindex(MVI)ꎬelasticityindex(EI)graduallyincreasedꎬwhilethemeshsizedecreasedꎬwhichindicatedthatviscoelasticityofBAMhydrogelincreased.ThisstudyprovidedarheologicalreferencefortheinsituinjectionofBAMhydrogelsintissueengineering.Keywords:bladderacellularmatrixꎻhydrogelꎻmicrorheologicalpropertiesꎻsol ̄geltransition新疆黑色生态建设年产6万吨高活性腐植酸产品项目新疆黑色生态科技股份有限公司拟在新疆玛纳斯县塔河工业园区建设年产6万吨高活性腐植酸产品项目ꎮ该项目总投资17685万元ꎬ占地168亩ꎬ将采用现代高新节能环保技术ꎬ依托新疆地区丰富的腐植酸资源ꎬ开发腐植酸系列产品ꎬ实现资源的综合利用和可持续发展ꎮ主要产品包括腐植酸㊁腐植酸盐㊁腐植酸有机肥ꎬ可根据市场需求适当调整产品种类结构ꎮ生产工艺是用腐植酸原料与钾㊁钠元素经过原料预处理后发酵贮存ꎬ用捏合机进行破碎混合㊁干燥机烘干得到合格产品ꎮ建设内容包括原料库㊁生产厂房㊁成品库㊁办公楼等ꎮ生产设备主要有捏合机㊁输送机㊁配料槽㊁盘式干燥和桨叶干燥设备等ꎮ晋煤恒盛化工实施40万吨合成氨60万吨尿素搬迁升级技改项目江苏晋煤恒盛化工股份有限公司拟选址在徐州新沂经济开发区苏化片区ꎬ实施年产40万吨合成氨60万吨尿素搬迁升级技改项目ꎮ项目分为两期工程建设ꎬ一期建设年产40万吨合成氨㊁60万吨尿素(含60万吨尿基复合肥)ꎬ4.78万吨浓硫酸生产装置ꎮ二期建设年产20万吨乙二醇ꎬ副产15万吨甲醇ꎬ0.67万吨碳酸二甲酯ꎬ1.76万吨混合多元醇生产装置ꎮ目前ꎬ该项目环境影响报告书征求意见稿已初步形成ꎮ湖北贮源环保科技建设磷石膏资源集中库项目湖北贮源环保科技有限公司在湖北省宜都市枝城镇六里冲村建设磷石膏资源集中库项目ꎬ建设规模为二等库ꎬ总有效库容7200万立方米ꎬ分为两期建设并且各期独立运行ꎮ目前先建设项目的一期工程ꎮ一期工程堆积子坝最终坝顶标高310米ꎬ有效库容约为4047万立方米ꎮ磷石膏资源集中库主要建设包括新建初期坝㊁新建副坝㊁场地平整㊁修筑地下水导排系统㊁铺设防渗系统㊁修筑排渗系统㊁新建排水竖井㊁斜槽排水隧洞㊁涵管排洪系统㊁新建回水调节池㊁布置监测设施及配套9千米的输送管道㊁再浆站等设施ꎮ(汪家铭)51第1期刘文景等.膀胱脱细胞基质预凝胶水溶液的微流变特性研究。

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