异硫氰酸荧光素(FITC)
(2) RB200标记
本品为无定形褐红色粉末，不溶于水，易溶 于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存，分 子量为580，最大吸收光谱为570nm，呈明亮 的橙色荧光，因与FITC的黄绿色有明显区别， 故被广泛用于对比染色或用于两种不同颜色 的荧光抗体的双重染色。结合时间持续12-18h。
FITC+RB200标记
(3) TMRITC标记
TMRITC为紫红色粉末，性能比较稳定， 分子量为443，最大吸收光谱为550nm，呈 橙红色荧光。其结合方法与FITC的直接标 记法相同，只是所加色素量为蛋白质量的 1/30-1/40，结合时间持续16-18h。
2 其它荧光物质
1）镧系螯合物 铕、铽、钐、铈等
吸收光的光量子数（激发光强度）
4 荧光寿命 指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后 产生的荧光随时间而衰退到一定程度所用的时间。 5 荧光的猝灭 指荧光物质的荧光辐射能力在受 到激发光较长时间的照射后会发生减弱的现象。
6 荧光偏振 FH--FL FH--FL
P=0,完全不偏振 P（-1，+1），部分偏振
P=
荧光色素的标记
目前适于标记蛋白的荧光色素主要有：
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，
FITC）
四乙基罗丹明（rho-damine B200，RB200）
四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine
isotheynate，TMRITC)
藻红蛋白（R-RE)
实际上目前应用最多的只有异硫氰酸荧光素一 种。
(1) FITC标记 FITC为黄色结晶形粉末，分 子量为389.4，易溶于水和酒精等溶剂中，溶 解后呈黄绿色荧光，最大吸收光谱为490495nm，FITC的溶液不稳定，易因水解或迭 聚而变质，故需在配好后2h内应用。
FITC含有异硫氰基，在碱性条件下能与IgG 的自由氨基（主要是赖氨酸的ε-氨基）结合， 形成荧光抗体结合物。一个分子的IgG有86个 赖氨酸残基，但一般最多只能标记15-20个。
P：偏振度；
FH:表示激发光起偏器和荧光检偏器的透射轴方 向平行时测得的荧光强度；
FL：表示以上两者方向相互垂直时测得的荧光 强度。
三、荧光物质 1 荧光色素
能够产生明显荧光并能作为染料使用的有 机化合物称为荧光色素或荧光染料。用于 标记抗体的荧光色素，必须具有化学上的 活性基因，能与蛋白质稳定结合，且不影 响标记抗体的生物活性及抗原抗体的特异 性结合。
荧光免疫技术 fluoroimmunoassay
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ） 又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和 显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
免疫荧光技术包括荧光抗体技术和荧光抗原技术， 因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检 测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合， 用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗 原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技 术，或称为免疫荧光技术。
二、荧光技术中有关的概念和参数
1 发射光谱 指固定激发波长，在不同波长 下所记录到的样品发射荧光的相对强度。 2 激发光谱 指固定检测发射波长，用不同 波长的激发光激发样品所记录到的相应的 荧光发射强度。
3 荧光效率 指荧光物质将吸收的光能转变成 为荧光的百分率。 荧光效率=
发射激光的光量子数（荧光强度）
2 荧光素标记 ①搅拌法（直接标记法） 取抗体球蛋白溶液10ml，碳酸盐缓冲液3ml， 生理盐水17ml，混合，在4℃电磁搅拌下加 FITC3mg（先溶解在3ml缓冲液中），在4℃ 继续搅拌4-6h，将结合物通过已平衡好的 Sephadex G25柱，以除去未结合的游离荧光 素。
② 透析标记法
适用于小体积的标记。
2）酶作用后产生荧光的物质（荧光底物）
4甲基伞酮-β-D半乳糖苷
四、荧光免疫分析常用仪器设备
荧光显微镜
荧光分光光度计
流式细胞仪
荧光显微镜
1 光源：高压汞灯、氙灯、卤素灯 2 滤板：隔热滤板、激光滤板（UG、BG）、 吸收滤板（OG、GG） 3 光路：透射光、落射光
a
透射光
b 落射光
第二节 荧光抗体的制备 1.免疫血清的制备 制备高效价的特异性抗血清是免疫荧光技术成功 的前提。通常以高效价的免疫血清为好，因为用 这种血清制备荧光抗体，即使其中含有少量非特 异抗体，也可以通过稀释法将其除去。 为提高血清效价，在制备免疫原时，通常采用大 剂量加佐剂，长程免疫，其中以弗氏不完全佐剂 最常用。即按抗原1份，无水羊毛脂1份，液体石 蜡2份混合，待充分乳化后，免疫动物，即可能 获得高效价的免疫血清。
该技术的主要优缺点
主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。
主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解
决，结果判定的客观性不足，
技术程序也还比较复杂。
基本原理 免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性 和敏感性与显微示踪的精确性相结合。
以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或 抗原)结合、但不影响其免疫学特性。然后将 荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和 鉴定未知的抗原。
将抗体球蛋白溶液用碳酸盐缓冲液 （0.25mol/L，pH9.0调动1% (W/V )，并装入 透析袋中，按蛋白质量的1/20称取FITC溶于10 倍抗体溶液量的碳酸盐缓冲液中，将透析袋浸 没于FITC液中，于4℃搅拌16-18h取出透析袋 于0.01mol/L，pH7.2 PBS中透析4h，将结合物 通过已平衡好的Sephadex G25柱，去除游离荧 光素。
影响标记的主要因素
ห้องสมุดไป่ตู้
温度:温度低，标记时间长，温度高，标记时间 应短。 时间:FITC0-4℃以6-12h为宜，20-25℃以1-2h为 宜，37℃30-45min为宜。 酸碱度:pH低时，标记较慢，pH值偏高（>10）， 抗体易变性，pH值9.0-9.5最为适宜。 标记量:抗体蛋白含量低，标记慢，以每毫升含 20-25mg蛋白为宜。
在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异 荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。在实际 工作中，由于用荧光素标记抗体检查抗原的方 法较为常用，所以一般通称为荧光抗体技术。
第一节 荧光的基本知识
一、 荧光
荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量 后，即刻引起发光；停止能量供给，发光亦 瞬即停止。荧光素是一种可吸收激发光的光 便能产生荧光，并能作为染料使用的有机化 合物，亦称荧光色素。