中药研究3　讨论本方法提取测柴胡皂苷a、d简便快捷,分离度较好,方法学研究表明本方法稳定可靠,可以作为柴胡药材中柴胡皂苷a、d的含量测定方法。

南柴胡和北柴胡药材中柴胡皂苷含量差异悬殊,以北柴胡中含量较高。

相同品种柴胡因产地不同皂苷含量也有较大差异,含量高低相差十几倍至几十倍之多,以湖南、陕西、甘肃产的北柴胡和四川产的南柴胡含量较高。

为保证药用柴胡的质量,急需在《中国药典》中规范柴胡药材中皂苷类成分的含量。

参考文献:[1]　Zhang L,Wang Y.Determinalion the content of saikosa2ponin a in Zhengcaihu Y in by HPL C[J].Chinese Tradi2 tional Patene Medicine(中成药),2004,26(1):79280. [2]　Lin D H,Mao R G,Wang Z H,et al.Quantitative analysisof saikosaponin a,c,d from23species of Radix Bupleuri in china by RP2HPLC[J].Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis(药物分析杂志),2004,24(5):4792483.(收稿日期　2007203222)冬虫夏草菌丝体发酵液中多糖的分离纯化与含量测定 徐增龙　张如松浙江中医药大学药学院　杭州　310053摘要:[目的]从冬虫夏草菌丝体发酵液中提取,分离虫草多糖,并建立样品中多糖的含量测定方法。

[方法]采用D101大孔树脂分离冬虫夏草菌丝体发酵液中的多糖;采用苯酚-硫酸法测定样品中多糖含量。

[结果]虫草多糖的得率为1412g/L;样品中虫草多糖的含量为7016%。

[结论]方法简便,准确,重现性好,可用于冬虫夏草菌丝体发酵液中虫草多糖的提取纯化和含量测定。

关键词:冬虫夏草菌丝体发酵液;多糖;大孔树脂;分离纯化;含量测定中图分类号:R28515　文献标识码:A文章编号:100525509(2007)0320376202Separation,Purif ication and Content T est of Polysaccharide in Z ymotic Fluid of Cordycepts Mycelium Xu Zenglong,Zhang Rusong Pharmacological I nstit ute of Zhej iang Chinese Medical Universit y,H angz hou(310053)Abstract:[Objective]To extract and separate polysaccharide f rom Cordycep s mycelium,and establish content test method of pol2 ysaccharide in sample.[Method]Take foramen magnum resin D101to separate polysaccharide f rom the zymotic fluid of Cordyceps mycelium,the phenol-SO2method to measure polysaccharide in sample.[Result]The receiving rate of polysaccha2 ride was14.2g/L;the content was70.6%from sample.[Conclusion]The said method is simple,convenient,correct,can be used for separation,purification and content measurement of polysaccharide from the zymotic fluid of Cordycep s mycelium.K ey w ords:zymotic fluid of Cordyceps mycelium;polysaccharide;foramen magnum resin;separation and purification;content measurement 冬虫夏草(Cordycep s)为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordycep s sinensis(Berk.)Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体,是高级滋补药品和名贵中药材。

随着它的药用价值不断增大和药用范围的不断扩大,对虫草的需求量也在不断的增加。

但是,由于天然虫草严格的寄生性及生长环境的特殊,且因人为因素的破坏,导致产量急剧下降,远远不能满足市场的需求。

因此,从20世纪70年代起,人类就开始利用现代生物发酵技术培育虫草菌丝体[1]来代替天然虫草,但是,目前对虫草菌丝体发酵液的开发利用,国内外还是鲜有报道。

大孔吸附树脂是20世纪60年代发展起来的新型精制方法[2]。

它是一种不含交换基团,具有大孔结构的高分子材料。

自从问世以来,已在环保、化工、医药等领域[3]得到广泛利用。

本研究采用D101大孔吸附树脂从虫草菌丝体发酵液中分离虫草多糖,且用苯酚-硫酸法测定了样品中多糖的含量,结果表明:本方法操作简单,结果准确,重现性好,为进一步的研究开发提供了依据。

1　仪器、材料、试剂与样品111　仪器与材料　TD5A2WS台式低速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);754型紫外分光光度计(上海精密仪器有限公司);D101大孔吸附树脂(天津制胶厂)。

浙江中医药大学学报2007年5月第31卷第3期　　徐增龙,等:　冬虫夏草菌丝体发酵液中多糖的分离纯化与含量测定112　试剂　D 2葡糖糖(中国药品生物制品鉴定所,批号110833-200503),乙醇,氯仿,正丁醇,苯酚,硫酸等(均为分析纯)。

113　样品　冬虫夏草菌丝体发酵液由浙江万丰集团制药有限公司提供。

2　方法与结果211　虫草粗多糖的提取　取虫草菌丝体发酵液7310mL ,用80%乙醇沉淀3次,室温下放置24h ,离心15min (3000r/min ),弃去上清液,取沉淀物,减压干燥,得粗多糖2119g 。

212　虫草粗多糖纯化　取上述粗多糖2119g ,加水66mL 溶解,取水溶液,采用sevag 法[4](1/5体积的氯仿,及1/5体积的正丁醇,剧烈震荡,静置分层后,过滤,取水层)去除蛋白质,操作3次后,将水层减压蒸干,用95%乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤粗多糖,减压干燥,得纯化粗多糖1814g 。

213　虫草多糖精制21311　树脂预处理[5]　取市售D101大孔吸附树脂,用乙醇加热回流洗涤,至洗脱液蒸干后无残留物,反复洗脱保存备用。

21312　装柱　以乙醇湿法装柱,用纯乙醇反复洗脱,至洗脱液与水混合不呈白色混浊为止(取1mL 乙醇液加5mL 水),再以蒸馏水洗脱至洗脱液无醇味,备用。

21313　精制　将纯化的粗多糖溶解(上样量∶树脂量=1∶8～10)加到已处理好的D101大孔吸附树脂柱上,先用水洗脱至洗脱液无色,流速约为1mL/min ,再用5倍量柱体积的30%乙醇、5倍量柱体积的50%乙醇洗脱,流速约为1mL/min ,分别收集洗脱液。

最后用95%乙醇洗脱至树脂无色,备用。

斐林反应[6]表明:多糖主要集中在水洗脱部位,浓缩水洗脱液后得到精制多糖1104g ,得率为1412g/L 。

214　样品中虫草多糖的含量测定21411　对照品溶液的制备　取于105℃干燥至恒重的葡糖糖对照品25010mg ,精密称定,置500mL 容量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,得015mg/mL 的葡萄糖对照品溶液。

21412　标准曲线的制备　精密量取对照溶液210ml 、410ml 、610ml 、810ml 、1010ml 于50ml 量瓶中,加水至刻度,摇匀。

分别精密吸取以上对照品溶液110ml 于10ml 试管中,加5%苯酚[7]试液110ml ,摇匀,迅速加浓硫酸510ml ,振摇2min ,置沸水浴中加热30min 后,取出冷却至室温。

另量取110ml 蒸馏水按上述方法操作,作为空白对照。

在490nm 波长处分别测定吸光度,以吸光度值A 为纵坐标,葡糖糖浓度C 为横坐标,进行线性回归,得回归方程为A =010077C -010002,r =01997121413　样品测定　取虫草多糖样品6410mg ,精密称定,置1000ml 容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀。

精密量取样品溶液110ml ,照标准曲线制备项下的方法,制备样品供试液,在490nm 波长处测定样品吸光度(n =3),并计算样品中多糖含量,结果样品中多糖以葡糖糖计含量为7016%。

3　讨论本研究用的发酵液中含有单糖、二糖等成分,在选用醇沉条件的过程中,我们考察了三种乙醇浓度分别为65%、80%和95%进行沉淀,结果表明:用80%乙醇沉淀3次后,单糖、二糖等干扰成分能够去除最完全,而且对多糖含量不影响。

蛋白质是在多糖沉淀中的主要杂质之一。

根据文献报道[9],目前去除方法有盐析法、等电点沉淀法、加热变性法、有机溶剂变性萃取法、膜过滤法。

本实验采用sevag 法去除蛋白,和其他几种方法比较,具有操作简单、省时,并得到良好的效果。

在考察上样量和树脂比例的过程中,我们结合比上柱量、比吸附量及比洗脱量等评价指标,进行了3个比例的比较,分别为1:5、1:10和1:15。

结果表明:在上样量和树脂比例为1:10的时候,多糖的纯化效果最佳,树脂的使用效率最大。

苯酚-硫酸比色法测定虫草多糖的原理是多糖在浓硫酸的作用下,先水解为单糖,迅速脱水形成糠醛衍生物,然后与苯酚缩合为有色化合物,在490nm 处有特征吸收。

本法简单,显色稳定,灵敏度高,重现性好。

参考文献:[1]　徐方云.冬虫夏草及发酵虫草菌丝体的临床应用[J ].药品评价,2005,2(4):255.[2]　王继峰.大孔吸附树脂在分离提取中药有效成分中的应用[J ].湖南中医药导报,2001,7(3):1252126.[3]　侯世祥.影响大孔吸附树脂吸附纯化黄连提取液因素的初步考察[J ].中国中药杂志,2000,25(11):6662668.[4]　STAUB A M.Methods in carbohydr.Chem[J ],1965,15(5):5211.[5]　孙越,曹喜红,潘艳红,等.大孔吸附树脂在中草药研究中的应用[J ].中医药信息,2002,19(2):23.[6]　方晓明,姚燕,夏淑霞,等.黄精多糖的提取及含量测定[J ].时珍国药研究,1995,6(1):16.[7]　施亚琴,杨培全,周俊国,等.红毛五加多糖的提取及含量测定[J ].华西药学杂志,1994,9(2):73.[8]　张晓静,刘会东.植物多糖提取分离及药理作用的研究进展[J ].时珍国医国药,2003,14(8):4952496.[9]　欧阳臻,常钰,李永辉,等.桑叶多糖的提取纯化及其含量测定[J ].时珍国医国药,2005,16(10):962.(收稿日期　2007203217)　浙江中医药大学学报2007年5月第31卷第3期。